stáhnout soubor - atestační práce

Institut postgraduálního vzdělávání ve zdravotnictví, Praha
Škola veřejného zdravotnictví
Molekulární epidemiologie a organizace
molekulárně epidemiologických studií
MUDr. Ludmila Vodičková, CSc
Konzultant: RNDr. M. Daniel, DrSc
Praha 2007
1
OBSAH
A. Cíl práce
1
B. Úvod
1
Úvod a definice molekulární epidemiologie
1
V čem se liší molekulární epidemiologie od „klasické“ epidemiologie?
4
Biomarkery v molekulární epidemiologii nádorů
5
Úskalí a limity molekulární epidemiologie:………………etické
7
…….logistické
7
Budoucnost molekulární epidemiologie
C. Praktická část
8
9
právní formulace úkolů a postavení jednotlivých partnerů v týmu
9
etická komise
10
technická příprava odběrů, zpracování, distribuce, transportu a analýz
získaného materiálu
10
informovaný souhlas
10
odběr krve (jiného biologického materiálu)
11
odběr anamnestických dat, dotazník
11
klinické údaje
laboratorní analýza biomarkerů a všech změřených údajů
12
vyhodnocování výsledků
12
integrace výsledků, interpretace
13
tvorba nových hypotéz, formulace otázek
13
publikace
13
informování zúčastněných osob o výsledcích v skupinových průměrech
13
informování jednotlivce
13
dopady pro legislativu, doporučení pro životní styl
13
socioekonomické dopady v ekonomice a zdravotním stavu obyvatel
14
D. Příklady z praxe
14
styrén
14
první série molekulárně epidemiologických studií, 1993 – 1996
14
2
druhá samostatná molekulárně epidemiologická studie, 1998
17
třetí série molekulárně epidemiologických studií, 2000 a 2004
20
celkové shrnutí molekulárně epidemiologických studií o styrénu
22
nádory
23
molekulárně epidemiologické studie na kohortách pacientů s nádory tlustého
střeva a konečníku a kontrol
23
E. Závěr
26
F. Literatura
28
3
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem atestační práci „Molekulární epidemiologie a organizace molekulárně
epidemiologických studií“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a
uvádím v bibliografii (§ 31 Autorského zákona 121/2000 Sb.).
Souhlasím, aby moje atestační práce „Molekulární epidemiologie a organizace molekulárně
epidemiologických studií“ byla digitálně zpracována a v elektronické formě zpřístupněna
odborné veřejnosti na webových stránkách IPVZ (§ 14, § 18 a § 37 Autorského zákona
121/2000 Sb.).
V Praze dne:10.září 2007
podpis
4
Souhrn:
Molekulární epidemiologie představuje účinný nástroj při zkoumání
komlexních onemocnění. Má svoje přísná pravidla, které se uplatňují od
plánování, načrtnutí a provádění takovýchto studií. Zásadním bodem je
interpretace dat. Komplexita, vysoké náklady a účast expertů z mnoha oborů
vyžadují širokou spolupráci na všech úrovních.
Klíčová slova: molekulární epidemiologie, pracovní expozice, genotoxicita,
styrén
Summary
Molecular epidemiology represents a powerful tool in addressing serious,
complex diseses. However, stringent rules have to be followed in planning,
designing and performing such studies. A crucial step is the final data
interpretation. Due to the complexity, costs and demands on distinguished
specialists, a collaborative approach is inevitable on the international scale.
Key words: molecular epidemiology, occupational exposure, genotoxicity,
styrene
5
Molekulární epidemiologie a organizace molekulárně
epidemiologických studií
A. CÍL PRÁCE.
1. popsat východiska oboru, jeho vývoj a trendy budoucího směřování
2. souborně formulovat kritické kroky v plánu a v praktickém provádění studie
3. aplikace teoretických postulátu v praxi, zobecnění vlastních zkušeností z provádění
molekulárně epidemiologických studií v Čechách a na Slovensku
4. kritické zhodnocení našich studií ve světle definice oboru molekulární
epidemiologie a v kontextu se světovou literaturou
B. ÚVOD
Úvod a definice molekulární epidemiologie
Pojem molekulární epidemiologie vyrůstal jako pokračování klinické epidemiologie a
podobor epidemiologie veřejného zdraví (McMichael 1994, Shields and Harris 1991).
Představuje přirozenou konvergenci molekulární biologie, epidemiologie a toxikologie,
přičemž zachovává široké rozpětí všech oborů k prosazování prevence nemocí. Pojem
„molekulární epidemiologie“ krystalizoval v 80. a 90. letech minulého století jako zásadní
propojení mezi projektem výzkumu lidského genomu (Human Genome Project) a
medicínou/veřejným zdravím (public health). (Perera et al, 1998, Ambrosene and Kadlubar
1997)
Molekulární epidemiologie byla v polovině 90 let definována jako „věda, která je
zaměřená na zhodnocení potenciálních genetických a environmentálních rizikových
faktorů, detekovaných na molekulární úrovni. Zkoumá jejich roli v etiologii, výskytu a
prevenci nemocí jak familiárně podmíněných, tak i v celém populačním spektru
(http://www.pitt.edu/~kkr/task.html).
V červenci 2004 bylo nalezeno víc než 3500 citací, když se do hledání v PubMed zadalo
heslo „molekulární epidemiologie“. Termín původně populární v podoboru infekčních
nemocí, doznal rozmachu při zkoumaní příčin chronických nemocí, především rakoviny
(Porta 2002a, Chen and Hunter, 2005)
Od začátku 80.let se – v souladu s definicí oboru a vývojem nových metod - objevuje
inkorporace
biomarkerů
(biochemických
6
nebo
molekulárních
změn/poškození
detegovaných ve vzorcích lidských tkání nebo tekutin) do epidemiologických studií. Cílem
bylo přesněji zhodnotit individuální expozici, dávku, preklinický efekt a vnímavost,
nejčastěji vůči karcinogenním látkám (Perera and Weinstein 2000).
Na přelomu tisíciletí si molekulární epidemiologie vytyčila následující úkoly, které jsou
stále platné:
1. Deskriptivní a analytické studie, zaměřené na zhodnocení interakcí mezi
organizmem a prostředím v procesu vzniku nemocí.
2. Vývoj preventivních strategických postupů pro kontrolu bakteriálních, parasitárních
a virových nemocí prostřednictvím molekulární diagnostiky.
3. Prevence nepřenosných nemocí a genetických poruch stanovením rizika vzniku
např. maligních onemocněních spolu s identifikací vnímavých jednotlivců
prostřednictvím genetického skríningu. (http://www.pitt.edu/~kkr/task.html).
V období po roce 2000 proběhla řada diskusí o pojetí a směřování molekulární
epidemiologie, která se stále více zaměřovala na výzkum rakoviny. Jeden směr tohoto
výzkumu se odvíjel z korelačních studií expozice - účinek a jeho rozšíření na molekulární a
subcelulární děje otevřelo nové perspektivy pro hodnocení rizika vzniku nádorů. Druhým
přístupem byla identifikace relevantních cest a/nebo kandidátních genů karcinogeneze v in
vitro studiích (např. s využitím specifických buněčných linií) s následnou extrapolaci pro
lidský organismus. Z těchto dvou směrů vyplývá naléhavá potřeba vybudovat funkční
vztahy vzájemné spolupráce napříč vědními obory.(Ambrosene and Kadlubar 1997). Bez
dobře naplánovaných molekulárně epidemiologických studiích na populacích by nebylo
možné stanovit riziko nemocí svázaných s přítomností nově identifikovaných genů, které
představují podklad pro individuální vnímavost organizmu vůči noxám všeho druhu.
V několika málo posledních letech byli na poli prevence nemocí definovány tři oblasti,
v kterých se uplatní molekulárně epidemiologický přístup:
1. identifikace etiologických faktorů a mechanizmů nemocí
2. modelování distribuce expozice a vnímavosti uvnitř populací
3. plán a monitorování intervencí (McMichael 1994, Perera 1996)
Předmětem molekulárně epidemiologických výzkumných studií je především stanovování
biomarkerů, které charakterizují jak interní expozici a biologicky účinnou dávku toxických
látek, tak včasný biologický účinek (prediktivní z hlediska vzniku rakoviny) a nakonec i
variace v individuální vnímavosti (genetické a negenetické faktory; Perera 1998). Příklady
biomarkerů expozice, vnímavosti a biologického účinku jsou ilustrovány v Obr. 1.
7
Obr. 1. Schematické znázornění biomarkerů na příkladu styrénu. BE – biomarkery
expozice, BS – biomarkery vnímavosti a BEFF - biomarkery biologického účinku.
Dosažení těchto cílů je závislé na dostupnosti moderního biotechnologického vybavení,
reagencií a materiálu. Molekulární testy, předtím než jsou aplikované v molekulárně
epidemiologické studii, musí být precizně validizovány s ohledem na citlivost, specificitu,
reprodukovatelnost a spolehlivost (http://www.pitt.edu/~kkr/task.html).
Ve svých důsledcích zůstává molekulární epidemiologie nevyhnutná pro rozvoj diagnostiky
a preventivních strategií rozvoje veřejného zdraví. Zároveň má své nezastupitelné místo
v poznání příčin maligních onemocnění, v optimalizaci a individualizaci terapeutických
postupů (Naccarati et al, 2007) a v závěru také pro diskusi o etických, právních a sociálních
otázkách,
které
jsou
nastoleny
na
(http://www.pitt.edu/~kkr/task.html).
8
základě
nových
poznatků.
V čem se liší molekulární epidemiologie od „klasické“ epidemiologie?
Obecná epidemiologie je věda, která deteguje, studuje a analyzuje zdravotní jevy
v populaci. Bez epidemiologie by bylo nemožné stanovit účinné preventivní strategie
předcházení nemocí nebo zlepšovat veřejné zdraví na populačním principu. Obecná
epidemiologie je vědeckou základnou veřejného zdraví.
Obr. 2 schematicky ilustruje vztah mezi oběma obory, epidemiologií klasickou a
molekulární.
Exposure
Cancer
„TRADITIONAL EPIDEMIOLOGY“
Exposure
Internal
dose
Biologically
effective
dose
Altered
structure/
function
Preclinical
disease
Cancer
Metastasis/
Prognosis
SUSCEPTIBILITY
„MOLECULAR EPIDEMIOLOGY“
Obr.2. Vztah mezi „tradiční“ a molekulární epidemiologií . (Schulte 1993; Chen and
Hunter, 2005).
Zatímco v klasické epidemiologii je vše mezi expozicí a účinkem mnohdy „černou
skříňkou“, i když hlavním kritériem je biologická plausibilita. (Schulte 1993), molekulární
epidemiologie přispívá k lepšímu porozumění patogenezí nemocí tím, že identifikuje
specifické cesty, molekuly a geny, které ovlivňují riziko rozvoje nemoci. Jako příklad
můžeme uvést skutečnost, že pro stanovení individuální vnímavosti jsou lépe využitelné
genetické molekulární parametry než informace z prostředí (např. pozitivní rodinná
anamnéza).
Molekulární epidemiologie přináší nové standardy do deskriptivních studií a využití
molekulárních testů v diagnostických kritériích zajistí mnohem homogennější skupiny
9
v identifikaci rizika (JS.Dorman 2007) a přispívá k zpřesnění klasifikace nemocí (Chen and
Hunter, 2005).
Biomarkery v molekulární epidemiologii nádorů
Donedávna platilo, že většině druhů rakoviny je možné předcházet, protože faktory, které
rakovinu vyvolávají jsou převážně exogenní. Molekulárně epidemiologické studie se
zaměřovali na zhodnocení vztahů mezi expozicí potenciálním kauzálním agens a vznikem
nemocí (incidencí klinicky diagnostikované rakoviny) nebo mortalitou. K biomarkerům
expozice a účinku přidávají biomarkery individuální vnímavosti a celý tento aparát testů se
používá v celé škále epidemiologických studií (průřezové, kohortové, případů a kontrol,
atd) (Perera and Weinstein 2000).
Biomarkery interní dávky: odráží koncentraci karcinogenů nebo jiných xenobiotik
v organizmu, jsou přesné, spolehlivé s vysokou relevancí k individuálnímu riziku (Haufroid
et al., 2002). Používají se v kombinaci s tradičními postupy (monitorování ovzduší na
pracovišti, vyhodnocení dotazníků na kouření, dietu a jiné expozice). Senzitivní analytické
metodiky a imunoeseje umožňují stanovení i nízkých koncentrací karcinogenů nebo jejich
metabolitů v různých buňkách, tkáních nebo tělních tekutinách. Zohledňují individuální
rozdíly v absorpci, metabolizmu, akumulaci a vylučování. K tomuto typů bimarkerů se
přirazují i vyštípnuté baze DNA (nukleobáze), stanovované v moči jako důsledky
depurinace/depyrimidinace spolu s enzymatickým štěpením v procesu opravy DNA.
(Perera and Weinstein 2000, Vodicka et al, 2006a, 2006b, Cooke 2005, Hecht 2006).
Biomarkery
biologicky
účinné
dávky:
určují
stupeň
interakce
karcinogenu
s makromolekulami, nejčastěji s DNA, nebo specifickými proteiny v krvi. Kovalentní
vazba na buněčnou DNA může vyústit v mutaci v kritických genech (Vodicka et al, 2006a).
Mimo individuálních rozdílu v absorpci, distribuci a metabolizmu, se uplatní i individuální
rozdíly v stupni opravy DNA (Vodicka et al, 2007). Množství adduktů se z praktických
důvodů stanovuje v buňkách periferní krve, buňkách bukání sliznice nebo placenty.
(přehledně pojednáno v práci Poirier 2004). Kvantitativní a kvalitativní vztah mezi addukty
v necílových a cílových tkáních nebyl zatím u člověka stanoven, ale je řada
experimentálních prací na zvířatech, které vztah mezi množstvím a typem adduktů v krvi a
jiných tkáních dokumentují (Vodicka et al, 2006b). Kromě kovalentní vazby reaktivních
meziproduktů biotransformace xenobiotik/chemických karcinogenů na DNA, exo - i
endogenní faktory mohou způsobit další poškození DNA: chybná párování, replikační
10
chyby, deaminace, metylace, ztrátu bazí a oxidaci (Christmann, 2003). Oxidativní
poškození
DNA,
opravovaná
bázově
excisní
reparací
(BER),
se
zdají
být
prekancerogenním poškozením genetické informace (Weiss 2005), další výše uvedené léze,
opravované DNA mis-match reparací mají velmi zřetelný vztah k familiární formě
kolorektálního karcinomu (syndrom HNPCC). (Hoeijmakers 2001). Metabolismus steroidů
a lipidů pak vede k řadě dalších endogenních DNA adduktů, z nich lze jmenovat addukty
akroleinu a malondialdehydu jako násleky lipoperoxidace (Feng et al, 2006)
Markery časného biologického účinku nebo změněné funkce: odráží různé typy
genotoxicity včetně DNA adduktů, chromozomálních aberací, malých delecí (ztráta
heterozygozity) a bodových mutací a to jak v cílové tkání tak v krevních buňkách. Jde
především o taková poškození, která se dále neopravují a přetrvávají po dobu života dané
buňky. V hodnocení genotoxických a karcinogenních účinků xenobiotik se nejčasteji
uplatnily frekvence mutací v HPRT genu a cytogenetické parametry (měřítko
chromozomálního poškození); (Kligerman 2007, Albertini 2007). Předpokládá se, že
mutační profil nebo spektrum mutací v určitých genech vypovídá rovněž o kauzálním
agens, které tyto změny vyvolalo. (Perera and Weinstein 2000). „Modelový“ HPRT gen
nemá však kauzální vztah k maligní transformaci a pouze ilustruje možné spektrum
mutací, vyvolaných daným agens, i v relevantních genech. Výběr HPRT genu je podmíněn
technickými, hlavně však etickými, problémy s odběrem biologického materiálu z cílových
tkání u dosud zdravých jedinců v rámci skríningu. Relevance a spektrum onkomutací
v souvislosti s environmentálními mutageny a karcinogeny byla velmi elegantně
analyzována v práci (Thilly 2003). Na druhé straně nejnovější práce naznačují, že většina
maligních transformací se odehrává v buňkách neschopných udržet stabilitu genomu
(mnohdy na základě změn v DNA reparačních mechanismech). Chromozomální
nestabilita, s dopady na patogenezi rakoviny, pak představuje manifestní příklad genomové
nestability.
Molekulárním
podkladem
chromozomální
nestability
jsou
hlavně
chromozomální přestavby, v menší míře pak genové mutace (Futreal et al. 2004). Četné
prospektivní studie ukazují pozitivní korelaci mezi frekvencí chromozomálních aberací a
vznikem rakoviny (Bonassi et al., 2000; 2004; 2005; Hagmar et al. 2004). Tento vztah byl
mimořádně významný pro nádory gastrointestinálního traktu a plic (Rossner et al. 2005,
Boffetta et al. 2006; Norppa et al. 2006). Chromozomální aberace jsou jedním z mála
validizovaných,
neinvazivních,
intermediárních
onemocněním.
11
markerů
vnímavosti
k maligním
Biomarkery individuální vnímavosti: popisují varianty v individuální genové/enzymové
výbavě člověka. Mnohostupňový proces karcinogeneze předpokládá celou řadu faktorů (v
součinnosti s expozicí noxám životního prostředí a vlivům životního stylu), které určují
pravděpodobnost, že se nádor vyvine u daného jednotlivce. Tyto faktory můžou být buď
vrozené nebo získané.
Existují vzácné, vysoce penetrantní dominantní mutace v genech (jako je p53 u
LiFraumeniho syndromu a mutace v genech DNA mis-match reparace; Duval and Hamelin,
2002), které vypovídají o vysokém individuálním riziku při velmi nízké incidenci nádoru v
populaci. Naproti tomu relativně běžně se vyskytující varianty v genech, které regulují
metabolizmus a detoxifikaci karcinogenů, mohou mít veliký dopad na atributivní riziko
rakoviny v populaci, i když je individuální riziko malé. Totéž platí pro další skupinu genů
s nízkou penetrancí, jako jsou geny kódující různé typy oprav poškozené DNA.
Markery diagnózy a markery odpovědi na léčbu: Příkladem může být stanovení
estrogenových a progesteronových receptorů u rakoviny prsu - umožní charakterizovat dva
druhy nádorů prsu, které mají odlišné chování a odpověď na léčbu. Podobně se do dalších
kategorií rozpadají i jiné typy nádorů podle např. genové exprese. (Chen and Hunter, 2005).
Oblast markerů, přispívajících k individualizaci a optimalizaci terapie maligních
onemocnění, je v současné době oblastí rychle se rozvíjející a expandující (Naccarati et al.,
2007).
Obecně lze konstatovat, že rozvoj nových metodik přináší nové možnosti, spektrum
analyzovaných biomarkerů se rozšiřuje a prohlubuje spolu s vývojem mechanistických
modelů v karcinogenezi, jak bylo dříve postulováno (Perera and Weinstein, 2000).
Úskalí a limity molekulární epidemiologie
Etické
Z povahy věci vyplývá, že výzkum, který se zabývá lidským genomem, evokuje nejvíc
otázek v oblasti etiky.
Etické hledisko se uplatňuje od tvorby designu studie přes identifikaci a nábor
vyšetřovaných osob, zpracování a použití dat, až po interpretaci výsledků. Praktický smysl
výsledků může být často nejasný, protože studie mají primárně odpovídat na otázky spíše
výzkumu než kliniky. Ve většině případů není stanoven rozsah „normálních“ hodnot
biomarkerů. Z tohoto hlediska sdělení o dopadech studie bývá obtížné.
Další spektrum problémů je spjato s otázkami vlastnictví a dostupnosti biologického
materiálu (např. v „bankách DNA“) pro úplně jiný výzkum, než pro jaký se uskutečnil sběr
12
vzorků. S tím souvisí otázka, jak zabezpečit identifikaci vzorků a zároveň zabránit zneužití
osobních údajů. Přetrvávající otázkou, je možný vliv potenciálu informací o biomarkerech
(především týkajících se genotypů) na život jednotlivců (rodin).(Schulte 1995).
Logistické
1. Laboratorní testy jsou velmi nákladné.
2. Z důvodů degradace, oxidace, metabolismu, nestability některých biomarkerů (např.
depurinace) atd. zkoumaných vzorků je možné najednou zpracovat omezený počet
vzorků.
3. Zásadním faktorem jsou limity spotřebního materiálu, roztoků, lidských zdrojů a
přístrojů.
4. Limity odběrů – u skupinových odběru např. exponovaných osob se nabízí příliš
velké počty v krátkém časovém okamžik, vzhledem ke kapacitě některých typů
analýz. Následovat musí další výběr vzorků, např.každý druhý, nebo jenom prvních
20 apod., s rizikem systematické chyby (bias). Naopak v jiných případech – při
odběru nově diagnostikovaných pacientů s rakovinou – přísun vzorků je
nepravidelný a po jednom, což vede k prodražení a nárokům na lidské zdroje
v příslušné laboratoři.
5. Pro hodnocení genotypů je potřeba počtů řádově ve stovkách, pro stanovení
např.funkčních testů oprav DNA je maximum možného dvě desítky vzorků
v jednom odběru (týdnu). Tento rozpor klade mimořádné nároky na interpretaci dat
s možností zavádějících závěrů. Jde především o přílišné zevšeobecnění bez
dostatečné korekce s ohledem na omezení příslušné studie (overinterpretation).
6. Řada existujících studie z poslední doby je dobře sestavena, co se týká počtu
vyšetření, ale potýká se s problémy náboru kohort v různých regionech – různý
životní styl a expozice pozadí (z prostředí) se odráží ve velkém rozpětí hodnot
biomarkerů. Mnohdy je analyzován stejný biomarker v různých laboratořích bez
validizace výstupů (mezilaboratorní srovnání a verifikace). Tento problém vyvstává
u analýz s podílem subjektivního hodnocení (vizuální skórování).
Budoucnost molekulární epidemiologie
Prohlubování poznání přináší další pokroky v genomice (whole-genome association
studies, microarrays), technologii mikroesejí a informatice. Tento trend je slibný z hlediska
rychlé identifikace polymorfních variant genů nebo změn v expresích genů, které následně
ovlivní jak odpověď tak vnímavost. Tradičně kritický přístup k hodnocení výsledků
13
akceleruje vývoj (Porta 2002a, 2002b, Husgafvel-Pursiainen 2002). Celogenomové studie
s sebou přinášejí rovněž některé problémy, jako jsou zevšeobecnění bez zvážení omezení
studií, nedostatečné zhodnocení role jednotlivých genů v relevantních cestách, začlenění
nevýznamných genů či jejich úseků, problémy s mnohačetným porovnáváním bez cílené
korekce, což může vést až k více než 20% chybě (falešně pozitivní výsledky).
Hledání nových pohledů je dále směřováno k hodnocení role výživy a specifických
dietárních složek, ke zhodnocení role energetického metabolizmu, inzulínu a dalších
růstových faktorů (http://www.pitt.edu/~kkr/task.html, Pechlivanis 2007).
Velkou výzvou je stanovení spolehlivých prediktivních biomarkerů v časné diagnostice
rakoviny. V prevenci má molekulární epidemiologie nezastupitelný úkol: identifikaci
„rizikových“ skupin spolu s odhadem rychlosti a účinnosti intervenčních zásahů (Perera
and Weinstein 2000). Velkou vážnost získává užití studia genotypů ve vztahu k predikci
prognózy onemocnění, k navržení optimalizované individualizované terapie a k přesnější
klasifikaci nemocí. (Wild 2002).
Projekty Human Genom Project a International HapMap Project se chýlí ke konci,
přičemž vyvstávají otázky, zda je rakovina výsledek nepříznivé kombinace genů za
přítomnosti „spouštěčů“ ze životního prostředí, nebo je dost vědeckých argumentů pro
interakci genů s životním prostředím. Studie celého genomu (whole genom studies)
umožňují detekci rizika nádoru v souvislosti s úlohou genů, které buď zatím nemají žádný
vztah k rakovině nebo jsou v regulačních regionech. Nevýhodou je veliký šum stanovení a
pozitivní nález jenom v případě, když jsou přítomny ty samé jednonukleotidové
polymorfismy (SNP)/haplotypy ve větší části případů. Proto se souběžně rozvíjí strategie
kandidátních genů (candidate genes approach) – stanovení SNP ve vybraných genech
s prověřenou funkcí. Další zpřesnění odhadu rizika (a snížení nákladů na výzkum) nabízí
využití vybraných populací, např. populace rodin s mnohočetným výskytem nádoru, kde
jsou „rizikové alely“ koncentrovány. (Houlston 2003; Hemminki et al, 2006a, 2006b).
C. PRAKTICKÁ ČÁST
Rozbor a shrnutí jednotlivých kroků v molekulárně epidemiologických
studiích na základě zkušeností naší laboratoře
právní formulace úkolů a postavení jednotlivých partnerů v týmu
14
Molekulárně epidemiologická studie začíná formulováním hypotéz a konstrukcí projektu.
Součásti projektu je ustavení pracovního týmu, obvykle jde o odborníky z různých oborů a
pracovišť. Je stanoven časový plán a harmonogram prací, očekávané výstupy a principy
určení autorství článků.
etická komise
Etické komisi je předložen projekt v úplném znění, včetně doplňujících materiálů (např.
informovaný souhlas, dotazníky atd.). Komise posuzuje jak etickou stránku hypotézy, tak
etickou stránku vlastního praktického provedení.
technická příprava odběrů, zpracování, distribuce, transportu a analýz
získaného materiálu
1. Měření relevantní škodliviny v prostředí – monitorování faktorů působících
v životním (pracovním) prostředí – např. koncentrace těkavých látek ve vzduchu,
koncentrace a velikost prachových částic ve vzduchu (osobní a stacionární
dozimetry po určitou dobu, např.jednoho týdne – v závislosti na technologii),
koncentrace škodliviny ve vodě, v půdě, v potravě atd., měření intenzity a typu
záření. Vzhledem k tomu, že je technicky nemožné kontrolovat veškeré škodliviny,
jsou vybrány reprezentativní látky s ohledem na zaměření studie (a technickou
proveditelnost).
2. Technické a materiálové zabezpečení odběru krve, moče, příp. kůže nebo odběr
rakovinné tkáně při operaci
3. Zabezpečení personální a technické logistiky, nutné k okamžitému zpracování
vzorků, kde hledané biomarkery podléhají rychlé degradaci.
4. Zabezpečení dostatku chladících zařízení pro chlazení vzorků na různý stupeň
teploty (např. krev na analýzu adduktů: -80°C, krev na analýzu genotypů -20°C,
krev na funkční testy DNA reparace +4°C, stanovení enzymatických aktivit a
genových expresí vyžaduje okamžitou izolaci lymfocytů a jejich zmražení
v tekutém dusíku).
5. Zabezpečení transportu vzorků z terénu do laboratoří.
6. Při přechodu hranic je zapotřebí zajistit potvrzení, podepsané vedoucím ústavu,
které obvykle obsahuje následující body: v rámci jakého projektu se uskutečnil
odběr, kdo vzorky převáží, co vzorky obsahují (krev, lymfocyty, DNA atd),
15
vyjádření o stupni nebezpečnosti vzorků (infekce, radiace apod.). Toto potvrzení má
být doloženo seznamem.
informovaný souhlas
Pro každého účastníka studie je třeba poskytnout individuální formulář na podpis. Musí
obsahovat vyjádření, že dotyčný ví, proč se studie dělá, ví, jaké analýzy se provedou s jeho
biologickým materiálem, že se pracuje s kódovanými vzorky a osobní údaje jsou
nedostupné členům týmů – klíč k nim má jenom jedna osoba.Ví, na koho se obrátit
s žádostí o interpretaci výsledků a poskytnutí informací.
odběr krve (jiného biologického materiálu)
Odběr moče: měření biomarkerů metabolizmu, měření produktů opravy DNA nebo
spontánní depurinace (vyštípnuté baze)
Odběr krve:
měření biomarkerů molekulárního poškození
měření biomarkerů buněčného poškození, parametry v séru (plazmě) -imunoglobulíny,
metylované bílkoviny;
měření biomarkerů celkové odezvy organizmu na noxu
stanovení genotypů
Odběr nádorové tkáně při operaci: stanovení mutací, genových expresí apod.
Odběr jiné tkáně při lékařském zákroku (mandle, polypy ve střevě) - stanovení mutací,
expresí apod.
Odběr zdravé tkáně – např. kůže (stanovení fotosenzitivních adduktů), nebo jiné tkáně jako
kontrolní vzorek k nádoru. Zde je velký etický problém, zda vědecký přínos opravňuje
odběr takovýchto vzorků. Na druhé straně porozumění molekulárních kroků při melanomu
lze vystopovat pouze porovnáním nádorové tkáně, příslušné lymfatické uzliny a zdravé
tkáně.
odběr anamnestických dat, dotazník
A. standardizovaný dotazník („laický“) obsahuje základní, jednoduché otázky týkající
se životního stylu.
sesazení a formulace otázek a délka dotazníku je důležitá pro respondenta (motivace
odpovědět pravdivě, schopnost soustředění) a z toho pak plyne spolehlivost a úplnost údajů.
16
systém kódování – měl by souhlasit s kódem vzorku krve (moče), seznam jmen (příp.
rodných čísel) má jeden člen týmu (odpovědný za ochranu osobních dat) a je uložen na
záložním médiu. Není volně k dispozici.
B. řízený dotazník – veden zaškolenou osobou, podrobný rozbor stravování, návyků,
medikace, koníčků, pohybových aktivit atd.
C. medicínský dotazník – vyplňuje se při studiích onkologických pacientů, má
poskytnout systematický přehled o nemoci (histologie, stádium nemoci - staging,
lokalita, metastázy) i o jiných, souběžných nemocech, včetně laboratorních
vyšetření. U každého typu nádoru se sbírají jiné údaje, a to ty, které jsou relevantní
k danému nádoru.
Ze všech typů dotazníku se data vkládají do tabulek, tvoří se databáze bez identifikačních
údajů.
Dotazníky se archivují v našich podmínkách minimálně 5 let po ukončení projektu.
klinické údaje
Využívají se anamnestické údaje v chorobopisech, dále údaje o diagnóze, léčbě,
komplikacích a odezvě na léčbu.
Tabelarizace údajů a tvorba databází jako v předchozím případě, v databázi se pracuje bez
identifikačních údajů. Jména a rodná čísla jsou pouze v jediné verzi, která je na záložním
médiu.
laboratorní analýza biomarkerů a všech změřených údajů
Organizace práce v laboratoři, systém značení, evidence, zpracování a skladování. Jedná se
obvykle o zaběhlý systém. Při velkém počtu vzorků (studie s několika tisíci účastníky) je
dobré vyčlenit jednoho člověka, který vede evidenci a má přehled o uložení vzorků.
Vnitřní standardy, vedení protokolů a laboratorních denníků jsou samozřejmou součástí
práce.
Zpracování
výsledku
–
záznamy
ze
všech
druhů
měření
(chromatogramy,
spektrofotogramy, počty buněk, počty zlomů, intenzita světelného signálu atd)–převedené
do standardní formy čísel
Databáze výsledků
vyhodnocování výsledků
17
Každá laboratoř vyhodnocuje svoje vlastní výsledky. Je prováděna statistika ve smyslu
analytickém (zhodnocení úspěšnosti a kvality analýz), když je k dispozici klíč
k rozkódování skupin, tak i deskriptivní statistika skupin.
Srovnání s předchozími sety výsledků, když se jedná o stejné parametry a metodiky.
U metod s velikým podílem subjektivního hodnocení – systém kontroly a mezilaboratorní
standardizace (např.chromozomální aberace).
Kompletace laboratorních výsledů z několika laboratoří a s údaji získanými z dotazníků
nebo chorobopisů.
integrace výsledků, interpretace
Je nejobtížnější části molekulárně epidemiologické studie. Obvykle se část výsledků zcela
vymyká hypotéze –musí se vyloučit záměna vzorků, laboratorní chyba, posunutí souboru
atd., pak nastupuje další fáze práce s literaturou, hledání podobných, alternativních studií
nebo experimentů, vzniká nová představa o sledovaných vztazích, domýšlí se vazby na
další děje v organizmu a dosahy do dalších systémů, atd.
tvorba nových hypotéz, formulace otázek
Otázky vyplynou zcela přirozeně z výsledků, formulace hypotéz je kompromis mezi
zamýšleným a možným.
publikace
Sepsání
celého
(části)
„příběhu“
je
zásadním
krokem
v procesu
molekulárně
epidemiologické studie. Nevyhnutné je jeho kritické posouzení vědeckou obcí. V této fázi
často vyniknou slabiny studie. V konečném součtu se kromě dobře napsaných dobrých
výsledků uplatní modernost (až módnost) řešené problematiky, velikost oboru apod.
informování zúčastněných osob o výsledcích v skupinových průměrech
informace o výsledcích všem zúčastněným ze souboru exponovaných (pacientů) i
kontrolních osob
informace o výsledcích vedení závodu
informace o výsledcích závodnímu lékaři
informace o výsledcích příslušnému zdravotnímu ústavu (hygienické stanici)
informace příslušnému ošetřujícímu lékaři – úzká spolupráce s klinickými pracovišti
18
informování jednotlivce
zachování principu lékařského tajemství
zohlednění komplexity výstupů – opatrná interpretace
dopady pro legislativu, doporučení pro životní styl
- stanovení (příp. potvrzení stávajících) biologických limitů v pracovním prostředí na
základě genotoxického účinku
- hodnocení genotoxicity látek – IARC, klasifikace, kritické posouzení kvality a závažnosti
studií
- ze studií s karcinomatózními pacienty vyplynou obecně platné poznatky a doporučení
(omezit koření, jíst více zeleniny apod.).
-popularizace výsledků
socioekonomické dopady – implikace v ekonomice a zdravotním stavu obyvatel
investice do ochrany pracovníků v chemickém průmyslu
včasná diagnostika nádorů – větší podíl vyléčených lidí
zdravý životní styl – prodloužení délky života
D. PŘÍKLADY Z PRAXE
Styrén
Od poloviny 80. let byly předmětem našeho zájmu otázky účinků rozpouštědel, mezi jinými
i styrénu. Styrén, podobně jako 1,3 butadién, benzén a akrylonitril, vykazoval mimo
akutních neurotoxických účinků i účinky genotoxické. Styrén byl a stále zůstává látkou
s širokým uplatněním v různých průmyslových odvětvích na celém světě, včetně Čech a
Slovenska – mnoho lidí je exponovaných vysokým pracovním expozicím (v ručních
laminovnách příjem až gramových množství styrénu za den). Rovněž expozice ze životního
prostředí je nezanedbatelná (potraviny balené na polystyrénu, tabákový dým, exhalace
z dieselových motorů) (IARC 1994, 2002). Za genotoxické účinky styrénu je zodpovědný
jeho reaktivní metabolit, styrén 7,8 oxid (SO), který vzniká v těle v řetězcích cytochromů
P450. Odbourání SO zajišťují především mikrozomální epoxid hydroláza, a v menší míře
glutathion S transferázy.( Vodička et al, 2002). Styrén byl v roce 1994 klasifikován IARC
19
jako možný lidský karcinogen, skupina 2B s omezenou průkazností karcinogenity u lidí.
SO byl klasifikován jako pravděpodobný karcinogen, skupina 2A (IARC 1994, 2002).
Molekulárně epidemiologickým studiím předcházela práce na syntetizování, identifikaci a
validizaci specifických SO adduktů na DNA jako markerů expozice a biologické účinné
dávky (Vodička and Hemminki, 1988a, Vodička and Hemminki, 1988b).
první série molekulárně epidemiologických studií, 1993 – 1996
První molekulárně-epidemiologické studie v naší laboratoři byla uskutečněna v malé
ruční laminovně ve středních Čechách, série odběrů v letech 1993-1996.
Cílem bylo nalézt včasné markery molekulárního a buněčného poškození po profesionální
expozici styrénu, jejich závislost na expozici a čase.
Biomarkery: stanovení SO-O6 guaninových adduktů v lymfocytech lidí exponovaných
v pracovním procesu styrénu, stanovení závislosti mezi rozsahem poškození DNA, výškou
a délkou expozice, pokus o stanovení kinetiky (perzistence a odbourávání) adduktů,
stanovení hemoglobinových adduktů a jednořetězcových zlomů DNA, stanovení vztahů
k biomarkerům metabolizmu, analýza mutací v HPRT genu. Všechny parametry porovnané
s hodnotami u kontrolních osob.
Výsledky: Jedna z prvních a nečetných studií, kdy byly stanovovány DNA addukty
specifické pro danou noxu kvantitativním způsobem. Hladiny specifických O6guaninových
adduktů byly vyšší u exponovaných lidí, relativně stabilní v průběhu sledování (3 roky),
neodbourávají se v čase vymezeném na dovolenou (14 dní), dobrá korelace s markery
expozice a metabolizmu, žádná korelace s mutacemi v HPRT – pravděpodobně se zde
uplatňují další faktory – především oprava DNA poškození. Lidé exponovaní příležitostně
nebo jenom v krátkodobých (minutových) nárazech vykazují relativně horší parametry
poškození DNA než osoby soustavně exponované vysokým koncentracím. Postulována
byla indukce metabolických cest a rychlejší odbourávání. Vyvstala otázka role DNA
reparací.
Na základě obdržených výsledků jsme načrtli možnou následnost dějů v genotoxicitě a
možné karcinogenicitě jak styrénu, tak i řady dalších xenobiotik (viz Obr. 3).
Nedostatky studie: malá populace, informovaný souhlas jenom ústně, omezený zdroj
anamnestických dat, neúplné informace o životním stylu (výživa, tělesná aktivita, medikace
apod.). Na druhé straně osoby účastnící se studie byly nekuřáci a byly opakovaně vyšetřeny
v průběhu několika let.
20
Závěr: styrénová expozice způsobuje změny markerů genotoxického poškození.
Zařazení styrénu do kategorie 2B1 expertní skupinou IARC je oprávněné.
Příprava další studie: Zavádění a validizace nových metodik, in vitro pokusy na
buněčných liniích, experimenty na zvířatech-kromě validizace nových metod i ověřování a
potvrzení dílčích výsledků získaných z předchozích studií, kritické hodnocení výpovědní
hodnoty biomarkerů ve vztahu k tomu, co chceme zjistit, k možnostem provedení a
finančním nákladům.
Obr.3. Kaskáda dějů v procesu mutageneze/karcinogeneze styrénu
Publikace:
1.
32
P-Postlabelling of DNA adducts of styrene-exposed lamination workers. P.
Vodička et al, Carcinogenesis, 14 (10), 1993, 2059-2061, IF: 5.366, Citace: 37
21
2. Persistence of O6 -guanine DNA adducts in styrene exposed lamination workers
determined by
32
P-postlabelling. P. Vodička et al, Carcinogenesis, 15 (9), 1994,
1949-1953, IF: 5.366, Citaces: 35
3. Styrene: from characterization of DNA adducts to application in styrene-exposed
lamination workers. K. Hemminki and P. Vodička, Toxicol. Lett., 77, 1995, 153161, IF: 2.784, Citace: 11
4. Biomonitoring of styrene exposed lamination workers: Measurement of O6-guanine
DNA adducts, DNA strand breaks and mutant frequencies in the hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase gene in T-lymphocytes. P. Vodička et al,
Carcinogenesis, 16 (7), 1995, 1473-1481, IF: 5.366, Citace: 59
5. Styrene oxide-induced HPRT mutations, DNA adducts and DNA strand breaks in
cultured human lymphocytes., T. Bastlová et al, Carcinogenesis, 16 (10), 1995,
2357-2362,
IF: 5.366, Citace: 31
6. Biomonitoring of styrene. P. Vodička et al, Arch. Public Health, 53, 1995, 111112
7. 7-Alkylguanine adducts of styrene oxide determined by
32
P-postlabelling in DNA
and human embryonal lung fibroblasts (HEL). P. Vodička et al, Carcinogenesis, 17
(4), 1996, 801-808, IF: 5.366, Citace: 9
8.
32
P-Postlabelling analysis of diastereomeric 7-alkylguanine adducts of styrene
oxide. R. Kumar et al, Carcinogenesis, 18, 1997, 407-414, IF: 5.366, Citace: 8
9. DNA-Adducts as markers of genotoxic effects of some environmental pollutants. P.
Vodička, et al, Proceeeding from ISSE symposium. I. Ciznar, G. Gulis, S.
Ftacnikova, K. Hatiar, V. Hladikova, A. Kaizlova, J. Tulinska (eds), 1998, pp. 111117
10. An evaluation of styrene genotoxicity using several biomarkers in a three-year
follow up study of hand lamination workers. P. Vodička , et al, Mutat. Res., 445,
1999, 205-224, IF: 2.122, Citace: 27
11. Future research directions in the use of biomarkers. K. Hemminki et al, Environ.
Health Perspect., 104 (S3), 1996, 459-464, IF: 5.861, Citace: 3
12. Adduct formation on DNA and haemoglobin in mice intraperitoneally administered
with styrene. W. Pauwels et al,. Carcinogenesis, 17 (12), 1996, 2673-2680, IF:
5.366, Citace: 29
22
druhá samostatná molekulárně epidemiologická studie, 1998
Další odběr ze skupiny molekulárně epidemiologických studii na styrénu se uskutečnil ve
výrobním družstvu na Slovensku. V této studii byla vyšetřovaná skupina početně větší, ale
mnohem heterogennější.
Cíl: vyšetřit vztah mezi genotypem a poškozením organizmu na molekulární a
buněčné úrovni po expozici styrénu. V této studii jsme poprvé aplikovali parametry
individuální vnímavosti.
Biomarkery: Parametry expozice, addukty DNA, jednořetězcové zlomy DNA, oxidované
baze v DNA, chromozomální aberace, parametry imunitní odpovědi (buněčné i humorální),
frekvence mutací v HPRT genu a polymorfismy v genech kódujících metabolizující
(cytochromy P450, mikrozomální epoxid hydroláza i glutathion S-transferázy) a později i
reparační enzymy (cesty bázové a nukleotidové excizní reparace a rekombinantní reparace).
Výsledky: Jednořetězcové zlomy a frekvence chromozomálních aberací(CA) byly
signifikantně ovlivněny výškou a trváním expozice. Frekvence HPRT mutací se zvyšovala
s počtem odpracovaných let v styrénovém provozu. Polymorfizmy genů metabolizujících
enzymů významně ovlivnili hladinu biomarkerů (vyšší CA u lidí s genotypem
odpovídajícím nízké a střední aktivitě epoxid hydrolázy). Poprvé jsme uplatnili analýzu
dalšího typu DNA adduktu specifického pro styrén jako důsledek aralkylace N1 pozice
adeninu. Dosavadní poznatky o DNA adduktech nám dovolily postulovat jejich úlohu
v kaskádě biologických, genotoxických a karcinogenních účinků xenobiotik (Obr. 4).
Lidé, kteří jsou vybaveni homozygotním divokým genotypem v XPD genu vykazují
nejvyšší hladiny biomarkerů poškození DNA, naopak, u nositelů divoké varianty genu
XRCC1 se našli nejnižší CA. Zdá se, že polymorfizmus v genech pro cyklin D1, XPD a
XRCC1 ovlivňuje počet imunologicky aktivních buněk. Imunoglobulín a jiné ukazatele
humorální imunity byly ovlivněny polymorfizmy v genech XRCC3 a XPC.
Závěr: styrén vyvolává změny v biomarkerech genotoxického poškození při
dlouhodobé expozici (v průměru 14 let). Otázka kumulace DNA či chromozomálního
poškození nebyla jednoznačně vyřešena. Spíše se zdá, že u chronické, masivní expozice
dochází k vytvoření dynamické rovnováhy mezi akumulací poškození a jejich reparacemi.
Nedostatky: i tato studie trpí malým počtem exponovaných jedinců (i když jich bylo 3krát
víc než v předchozích studiích), obzvlášť v souvislosti s implementací genotypů. Tento
nedostatek není zcela adekvátně vyvážen celou škálou různých biomarkerů, z nich řada je
specifických. Nepodařilo se rovněž zajistit všechny analýzy (hemoglobínové addukty).
23
Některé výsledky jsou signifikantní na nízkých hladinách významnosti, bez ověření na větší
kohortě nemůžeme rozlišit, zda se nejedná o náhodný nález. To platí především pro
výsledky s genotypy. V době, kdy byla studie plánována, nebyly dostupné informace o
funkčních dopadech polymorfismů v reparačních genech (který gen se účastní kterého typu
reparace a vliv na enzymovou aktivitu).
Příprava další studie: Vypracování metodik pro stanovení nových biomarkerů (další typy
SO DNA adduktů, další analytické přístupy k jejich stanovení), experimenty na zvířatech validizace nových metod (stanovení mikrojader, addukty ). Pilotní experimenty pro studium
vztahu genotyp-fenotyp v souvislosti s DNA reparací.
Obr. 4. Spektrum a osud styrénem indukovaných DNA adduktů a jejich předpokládané
biologické důsledky.
Publikace:
1. Biomonitoring of occupational exposure to styrene in a plastics lamination plant. M.
Somorovská et al, Mutat. Res., 428. 1999, 255-269, IF: 4.111, Citace: 23
2. The comet assay in biomonitoring of occupational exposure in rubber factory and
plastics lamination plant. Comparison with cytogenetic and immune biomarkers. M.
Somorovská et al, Neoplasma, 46, 1999, 23-25, IF: 1.247, Citace: 2
24
3. Changes in cellular immunity among workers occupationally exposed to styrene in
a plastics lamination plant. J. Tulínská, et al, Am. J. Ind. Med., 38, 2000, 576-583,
IF: 1.433, Citace: 5
4. Adenine N-3 is a main alkylation site of styrene oxide in double-stranded DNA. M.
Koskinen et al, Chem.-Biol. Interactions, 124, 2000, 13-27, IF: 1.800, Citace: 18
5.
32
P-postlabelling/HPLC analysis of various styrene-induced DNA adducts in mice.
M. Koskinen et al. Biomarkers, 6, 2001, 173-189, IF: 2.203, Citace: 3
6. Association between genetic polymorphisms and biomarkers in styrene exposed
workers. P. Vodička et al, Mutat. Res.,482, 2001, 89-103, IF: 4.111, Citace: 19
7. Immune markers in biological monitoring of occupationally exposed workers. M.
Kuricová et al, Biologia, 56, 2001, 293-296, IF: 0.213
8. DNA adducts, strand breaks and micronuclei in mice exposed to styrene by
inhalation. P. Vodička et al, Chem.-Biol. Interaction, 137, 2001, 213-227, IF:
1.800, Citace: 12
9. Kinetics of formation of specific styrene oxide adducts in double-stranded DNA. M.
Koskinen et al, Chem.-Biol. Interaction, 138, 2001, 111-124, IF: 1.800 , Citace: 6
10. Identification of 1-adenine DNA adducts in workers occupationally exposed to
styrene. M. Koskinen et al, J. Occup. Environ. Med., 43, 2001, 694-700, IF:
1.942, Citace: 3
11. The role of various biomarkers in the evaluation of styrene genotoxicity. P. Vodička
et al., Cancer Detect. Prevent., 27, 2003, 275-284, IF: 1.628, Citace: 5
12. DNA repair and cyclin D1 polymorphisms and styrene-induced genotoxicity and
immunotoxicity. M. Kuricová et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 207, 2005, S302S307, IF: 4.722
13. DNA repair and cyclin D1 polymorphisms and styrene-induced genotoxicity and
immunotoxicity. M. Kuricova , et al, Toxicol. Appl. Pharmacol., 207, 2005, S302S309, IF: 4.722
14. Repair capacity of oxidative DNA damage and relation to other biomarkers in
styrene exposed workers. J. Slyskova et al, Mutat. Res., accepted, IF: 2.122
třetí série molekulárně epidemiologických studií, 2000 a 2004
Další odběry týkající se styrénu proběhly v roce 2000 a 2004. Jednalo se o tři závody na
výrobu laminátových dílu ve stejné oblasti východních Čech.
25
Cíl: vyšetřit vztah mezi genotypem a poškozením organizmu na molekulární a
buněčné úrovni po expozici styrénu na větší populaci, ověřit výsledky předchozích
studií.
Biomarkery: Stanovení specifických DNA adduktů, hemoglobínových adduktů,
jednořetězcových zlomů DNA, chromozomálních aberací a mikrojader v krevních buňkách
(lymfocyty) a zhodnocení jejich případné akumulace v organizmu v průběhu času.
Vyšetření role adaptace a/nebo selekce v genotoxickém riziku styrénu. Zároveň stanovení
rychlosti odbourávání 8-oxoguaninů (test DNA opravy). Určení polymorfizmů v genech
metabolizmu a DNA opravy. Analýza moče – stanovení jak běžných metabolitů styrénu,
tak hypotetického produktu oxidace (arén oxidace) na benzénovém jádře, konjugátu 4-vinyl
fenolu, a stanovení dalších regioizomerických forem merkapturových kyselin.
Výsledky: Hladiny DNA adduktů byly pod detekčním limitem. Frekvence mikrojader (jako
odraz vážnějšího chromozomálního poškození) korelovala s expozicí, zatímco frekvence
chromozomálních aberací neposkytly dostatečně průkazné výsledky svědčící pro vliv
styrénu na chromozómovou integritu. Jednořetězcové zlomy v DNA překvapivě klesaly se
vzrůstající koncentrací styrénu, zatímco kapacita bázové excizní reparace s expozicí
vzrůstala. Byla dále nalezena signifikantně vyšší schopnost opravovat leze DNA u
exponovaných než u kontrol, což naznačuje možnost adaptačních procesů u osob chronicky
exponovaných koncentracím pod povoleným biologickým limitem, jakož i možnost
indukce DNA reparačního systému. Nalezené změny v hladinách jednořetězcových zlomů
(významné zvýšení) v souvislosti s variantní alelou XRCC1 genu naznačuje nižší kapacitu
BER u nositelů tohoto genotypu, což bylo později prokázáno (Vodička et al., 2007).
Souvislost mezi polymorfismy v XPC genu (nukleotidová excizní reparace; NER) a
jednořetězcovými zlomy nelze v současné době kauzálně vysvětlit. Velmi zajímavé pilotní
výsledky přinesla analýza vztahů mezi jednořetězcovými zlomy v DNA a různými
relevantními genotypy v kombinaci (tzv. gene-gene interactions). V této souvislosti jsme
nalezli významně vyšší frekvencí chromozomálních aberací u nositelů genotypu divokého
typu v XPD Lys751Glu, což naznačuje roli NER při vzniku chromozomálních poškození.
Prokázán byl metabolit 3,4 arénoxidu v souvislosti s expozicí styrénu, avšak jeho
biologická významnost je zatím nejasná. Při současném stavu poznání se nedá ani
odhadnout, zda se tento reaktivní metabolit podílí na genotoxickém účinku styrénu či
nikoliv.
Závěr: Platný biologický limit styrénu, stanovený na základě neurotoxických účinků
(100 mg/m3), chrání pracovníky i před jeho genotoxickým účinkem. U pracovníků
26
v expozici se pravděpodobně indukují enzymy reparačních systému jako reaktivní
obrana organizmu proti poškození.
Není dořešena otázka dalšího vývoje celého procesu: jak dlouho indukce vydrží a jaké
následky pro celý organizmus přinese (vyčerpání ?). Otevřeny jsou i další otázky: Je tato
tendence platná i pro další xenobiotika? Lze předpokládat určité selekční tlaky v populaci,
tj. v rizikových oblastech (provozech) nalezneme osoby, které jsou schopny se
s genotoxickou zátěží lépe vyrovnat?
Příprava další studie: experimenty na myších, kvantitatívní aspekty expozice, verifikace a
reanalýza mikrojader, vývoj a zavádění nových metod na měření schopnosti opravovat
poškození DNA, především vývoj funkčních testů pro NER.
Publikace:
1. New aspects in biomonitoring occupational exposure to styrene. Vodička et al, Int.
Arch. Occup. Environ. Health 75, 2002, S75-S85, IF: 1.520, Citace: 4
2. Spectrum of styrene-induced DNA adducts: the relationship to other biomarkers and
prospects in human biomonitoring. P. Vodička et al, Mutat. Res. 511, 2002, 239254, IF: 7.579, Citace: 10
3. The role of various biomarkers in the evaluation of styrene genotoxicity. P. Vodička
et al, Cancer Detect. Prevent., 27, 2003, 275-284, IF: 1.622, Citace: 3
4. A re-assessment of styrene-induced clastogenicity in mice in a subacute inhalation
study. G. Engelhardt et al, Arch. Toxicol., 77, 2003, 56-61, IF: 1.787, Citace: 2
5. Assessment of biotransformation of the arene moiety of styrene in volunteers and
occupationally exposed workers. P. Manini , et al. Toxicol. Appl. Pharmacol., 189,
2003, 160-169, IF: 4.722, Citace: 9
6. Genetic polymorphisms in DNA repair genes and possible links with DNA repair
rates, chromosomal aberrations and single-strand breaks in DNA. P. Vodička et al,
Carcinogenesis, 25, 2004, 757-763 IF: 5.366, Citace: 50
7. Cytogenetic markers, DNA single-strand breaks, urinary metabolites, and DNA
repair rates in styrene-exposed lamination workers. P. Vodička, et al, Environmental
Health Perspectives, 112, 2004, 867-871, IF: 5.861, Citace: 5
8. 7-Alkylguanine adduct levels in urine, lungs and liver of mice exposed to styrene by
inhalation. P. Vodicka et al , Toxicol. Appl. Pharmacol., 210, 2006, 1-8 IF: 4.722
27
9. Genetic polymorphisms and possible gene-gene interactions in metabolic and DNA
repair genes: effects on DNA damage. A. Naccarati et al, Mutat. Res. (Fund.
Molec. Mech. Mutagen.), 593, 2006, 22-31, IF: 4.111
10. Styrene metabolism, genotoxicity and potential carcinogenicity. P. Vodicka, et al,
Drug Metab. Rev., 38, 2006, 1-49 IF: 5.754
11. Association of DNA repair polymorphisms with DNA repair functional outcomes in
healthy human subjects. P. Vodicka et al, Carcinogenesis, 2007 Mar;28(3):657-64
IF: 5.366
Celkové shrnutí všech molekulárně – epidemiologických studií o účincích
styrénu
Styrén atakuje makromolekuly, je genotoxický. Organizmus je schopen vyvinout
systém obranných reakcí vůči chemické zátěži. Jsou jedinci, kteří jsou pro expozici
chemickým látkám lépe vybaveni než jiní (v závislosti na genotypech a jejich
kombinacích a v závislosti na kapacitě detoxifikačních a reparačních systémů). Zdá
se, že se uplatňuje i princip selekce (v provozech se vyskytují lidi, kteří mají určitý
genotyp, signifikantně častěji). Mechanizmy této selekce jsou dosud neznámé.
Dodržování platných limitů je zásadní v otázkách dalšího poškození.
nádory
S pokračujícím pokrokem v systému regulačních opatření klesají expoziční hladiny a
změny v biomarkerech jsou na hranici detekce. Nicméně, stále jsou exponovány tisíce lidí
potenciálním chemickým karcinogenům. Tato skutečnost se neodráží v úměrně zvýšené
incidenci nádorových onemocnění u takto exponovaných lidí. Přibývá však osob
s diagnostikovanými nádory z běžné, neselektované populace. Proto jsme náš zájem obrátili
na pacienty, kteří trpí maligním onemocněním v porovnání s osobami bez nádorů, abychom
vyšetřili biomarkery účinku a individuální vnímavosti a zmapovali tak rozdíly mezi
zdravými a nemocnými v těchto ukazatelích.
V mnoha studiích je popsaná existence rozsáhlých interindividálních variací jak
v biotransformaci, tak v schopnosti opravovat DNA. (Collins et al, 2001, Collins et al.
2002) Organismus disponuje několika účinnými způsoby, kterými opravuje vzniklé leze na
DNA (addukty, jedno a dvouřetězcové zlomy, oxidované baze). Předpokládá se že
28
v opravných procesech savců se uplatní víc než 80 genů. Dalších 40 genů se podílí na
rozpoznání poškození a kontrole buněčného cyklu a souvisí, sice nepřímo, ale velmi
zásadně, se systémem DNA opravy (Mohrenweiser et al. 2002). Jedinci s kapacitou oprav
pod populačním průměrem mohou být ve zvýšeném riziku vzniku nádorového onemocnění.
molekulárně epidemiologické studie na kohortách pacientů s nádory tlustého
střeva a konečníku a kontrol
V současné době probíhají molekulárně epidemiologické studie, které sledují pacienty
s maligním onemocněním (sporadický karcinom tlustého střeva a konečníku, CRC) ve
srovnání s kontrolní populací.
Cíl: najít molekulární prediktivní markery maligních onemocnění, především u
sporadického karcinomu tlustého střeva a konečníku (obr.5), vymezit rozsah platnosti
biomarkerů, přispět k individualizaci léčby a zpřesnění prognózy.
Předpokládaný mnohostupňový proces karcinogeneze,
navrhnutý pro CRC: potenciální body pro sběr biomarkerů
Accumulation
of DNA
damage
XME
CYP, GST
Attempt for
DNA
replication
Genetic
DNA
mutations
Signalling
pathways
Increased
proliferatio
n
Polyps
number&
histology
of polyps
TS,
oncogenes
APC, K-ras,
p53
Grade of
displasia
CRC Clinical
presentation
Adenoma
formation
Dysplasia
DNA repair
enzymes
DNA
adducts
catenin
COX-2
Invasive
cancer
General concept adopted and modified from Gareca et al.,
(2003) Eur. J. Cancer 39, 1041-52.
Obr.5. Karcinogeneze v případě kolorektálního karcinomu, kritické místa pro stanovení
biomarkerů
Biomarkery: Stanovení polymorfismů u genů nízké penetrance (např. DNA reparace a
genů kontrolujících úroveň metylací). Z důvodu úzké souvislosti mezi cestami DNA oprav
a regulace buněčného cyklu, naše pozornost bude věnována genotypizaci genů
29
kontrolujících buněčný cyklus a proliferaci. Posouzena bude role výše uvedených
polymorfismů pro určení rizika vzniku a další progrese sporadického karcinomu tlustého
střeva a konečníku ve studii pacientů a kontrol; naše současné představy o individuální
vnímavosti vůči výše zmíněnému onemocnění jsou schematicky představeny na Obr. 6.
Posouzena rovněž bude úloha haplotypů. Stejný postup je uplatňován u skupiny genů DNA
mis-match reparace, vysoce relevantních pro dědičný nepolypózní kolorektální karcinom
(HNPCC). Jejich polymorfismy, haplotypy a mikrosatelitní nestabilityje sledována ve
vztahu k riziku sporadické formy karcinomu tlustého střeva.
U nově diagnostikovaných pacientů s CRC se zaměřujeme na stanovení frekvencí
chromozomálních aberací jako ukazatele chromozomální nestability. V této studii se
snažíme eliminovat veškeré faktory, které mohou přispívat k arteficiálním výstupům.
Výsledky: V publikované části studie (prvních 532 CRC pacientů a 532 kontrol) je
doložené zvýšené riziko nádoru u nositelů homozygotních variant současně´v genech APE1
a hOGG1, tento vztah se zvyšuje s věkem. Polymorfizmy v genech účastnících se
inzulínové odpovědi vykazují spíše protektivní účinek (Pechlivanis 2007).
Závěry:. Studie je rozpracovaná, zdaleka nejsou hotové všechny plánované analýzy.
Pokračuje komplexní sběr informací o pacientech, jakož i vlastní sběr vzorků. Molekulární
faktory by měly být mechanisticky verifikovány v tkáních polypů tlustého střeva, které
vykazují různou formu dysplazie a jsou pečlivě histologicky charakterizovány. Vzhledem
ke komplexitě onemocnění a velmi obtížné verifikaci jednotlivých dílčích nálezů naše
pracoviště úzce spolupracuje s German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, SRN,
a s Cancer Research UK, Londýn, Velká Británie.
30
1 SNP / 2SNPs/….
1 SNP / 2SNPs/….
1 SNP / 2SNPs/….
1 SNP / 2SNPs/….
1 SNP / 2SNPs/….
Haplotypes
Haplotypes
Haplotypes
Haplotypes
Haplotypes
Gene 1
Gene 2
………
………
Gene n
Internal environmental influence
External environmental influence
Individual Susceptibility
NER, BER, DSB, MMR, Rev. Repair
Pathway 1
DNA Repair
Pathway 3
Metabolism
Pathway 2
Cell-cycle
Other
Pathways
Pathway 4
Immune response
Cancer Risk
Normal epithelium
Adenomas
Carcinomas
Metastasis
Obr.6. Předpokládaná role individuální genetické vnímavosti spolu s externími/interními
faktory ve vzniku rizika sporadického CRC
Publikace:
1. Úloha
genetických
polymorfismů
biotransformačních
enzymů
v
rozvoji
kolorektálního karcinomu (The role of genetic polymorphisms in biotransformation
genes for the development of colorectal cancer). In Czech, S. Susova, J. Novotny, P.
Vodicka, P. Soucek, Klin. Onkol., 18, 2005, 188-193
2. Sporadic colorectal cancer and individual susceptibility: a review of the association
studies investigating the role of DNA repair genetic polymorphisms. A. Naccarati,
B. Pardini, K. Hemminki, P. Vodicka. Mutat. Res.-Reviews, 635, 2007, 118-145,
IF: 7.579
3. Association study between DNA repair genetic polymorphisms and risk of
colorectal cancer in Czech Republic. B. Pardini, A. Naccarati, J. Novotny, Z.
Smerhovsky, L. Vodickova, E. Tulupova, V. Polakova, M. Hanova, R. Kumar, M.
Bortlik, M. Kunovska, R. Barale, K. Hemminki, P. Vodicka Mutat. Res.-Fundam.
Mechanisms, submitted
31
4. Insulin pathway related genes and risk of colorectal cancer: INSR promoter
polymorphism shows a protective effect, Pechlivanis, S. et al, Endocrine-Related
Cancer, 2007, přijato k publikaci
5. Functional polymorphisms in ATP-binding cassette C3/multidrug resistance
associated protein 3 (ABCC3/MRP3) and colorectal cancer susceptibility, D. Campa
et al., Submitted
6. Polymorphisms within micro-RNA binding sites and risk of sporadic colorectal
cancer in Czech Republic. S. Landi et al, Cancer Res. submitted
D. ZÁVĚRY:
Molekulární epidemiologie je důležitým nástrojem k poznání příčin nemocí, především
infekčních a chronických (z nich nejdůležitější se stávají nádory), ale i jiných, jako jsou
kardiovaskulární nemoci, cukrovka, obezita atd.
Výsledky molekulárně epidemiologických studií jsou přínosem k vědeckému zkoumání,
když vychází z pečlivě naplánovaného a ještě pečlivěji provedeného projektu. Každá
nedokonalost a i drobné selhání na kterékoliv úrovni mohou přispět k systémové chybě a
následně k zavádějícím interpretacím.
V oblasti molekulárně epidemiologického výzkumu nádorových onemocnění je několik
tezí, které ve zkratce shrnují celý problém a při plánování musí být respektovány:
1. rakovina má dědičnou složku – jinak by nebyly geny důležité
2. geny představují rizikový faktor – jinak by se neuplatnily
3. geny musí být funkční – jinak by se neprojevily
4. expozice ze životního prostředí musí být skutečná, kauzální – jinak by se nemohla
spolupodílet na vzniku nádorového onemocnění.
Při plánování molekulárně epidemiologických studii je dobře si uvědomit, že sledování
interakcí mezi faktory životního prostředí a genetickými faktory je poněkud ošidná hra
velkých čísel. Představme si soubor 1000 pacientů a 1000 kontrol, 20 genotypů (každý ve
třech variantách) a 5 dichotomizovaných faktorů z životního prostředí (ano – ne). Z toho
jednoduchou aritmetikou (20x3x5=600) dostaneme celkem 600 porovnání, t.j. v každé
skupině 1.6 člověka. Tento fakt představuje velké úskalí v problematice sporadických
maligních onemocnění s očekávanou souhrou četných genetických a environmentálních
vlivů.
32
Proto se musí hledat nové cesty a metodiky, jak obejít nevýhody a profitovat ze silných
stránek molekulární epidemiologie.
Díky komplexnosti řešených problému se vědci neobejdou bez úzké spolupráce v celém
spektru oborů: kliniků, statistiků, molekulárních biologů, patologů, histologů, hygieniků,
analytických chemiků, fyziků atd a to jak v nejužším okolí, tak i na mezinárodním poli
33
F. LITERATURA:
1)
ALBERTINI R.J, SRAM R.J, VACEK P.M,. LUNCH J, ROSSNER P,. NICKLAS
J.A, MCDONALD J.D, BOYSEN G, GEORGIEVA N, SWENBERG J.A.
Molecular epidemiological studies in 1,3-butadiene exposed Czech workers:
Female-male comparisons, Chem. Biol. Interact. 2007, 166, 63-77.
2)
AMBROSENE CB, KADLUBAR FF. Toward an integrated approach to molecular
epidemiology, AM J Epidemiol. 1997;146(11):912-8
3)
BOFFETTA P, VAN DER HEL O, NORPPA H, FABIANOVA E, FUCIC A,
GUNDY S, LAZUTKA J, CEBULSKA-WASILEWSKA A, PUSKAILEROVA D,
ZNAOR A, KELECSENYI Z, KURTINAITIS J, RACHTAN J, FORNI A,
VERMEULEN R, BONASSI S. Chromosomal aberrations and cancer risk: Results
of a cohort study from Central Europe. Am J Epidemiol 2007, 165(1):36-43
4)
BONASSI S, HAGMAR L, STROEMBERG U, MONTAGUD AH,
TINNERBERG H, FORNI A, et al. Chromosomal aberrations in lymphocytes
predict human cancer independently of exposure to carcinogens. Cancer Res. 2000,
60: 1619-1625
5)
BONASSI S, ZNAOR A, NORPPA H, HAGMAR L. Chromosomal aberrations and
risk of cancer in humans: an epidemiologic perspective. Cytogenet Genome Res.
2004 104(1-4): 376-382.
6)
BONASSI S, UGOLINI D, KIRSCH-VOLDERS M, STROMBERG U,
VERMEULEN R, TUCKER JD. HUMAN POPULATION STUDIES WITH
CYTOGENETIC BIOMARKERS: REVIEW OF THE LITERATURE AND
FUTURE PROSPECTIVES. Environ Mol Mutagen. 2005 45(2-3):258-70.
7)
COLLINS A.R, DUSINSKA M, HORVATHOVA E, MUNRO E,SAVIO M AND
STETINA R. Interidividual differences in repair of DNA base oxidation measured
in vitro with the comet assay. Mutagenesis, 2001, 16, 297-301
8)
COLLINS A. AND HARRINGTON V.Repair of oxidative DNA damage: assessing
its contribution to cancer prevention. Mutagenesis, 2002, 17,489-493
9)
COOKE M.S, EVANS M.D, DOVE R, ROZALSKI R, GACKOWSKI D, SIOMEK
A, LUNEC J, OLINSKI R. DNA repair is responsible for the presence of
oxidatively damaged DNA lesions in urine. Mutat. Res. 2005, 574(1-2):58-66.
10) DUVAL A. AND HAMELIN R. Genetic instability in human mismatch repair
deficient cancers. Ann. Genet. 2002, 45, 71-75
11) DORMAN
J.S,
Introduction
to
Molecular
Epidemiology,
http://www.pitt.edu/~super1/lecture/lec0131/
Updated
(September/08/2007),
cit.2007-09-08
12) FENG Z, HU W, MARNETT LJ, TANG MS. Malondialdehyde, a major
endogenous lipid peroxidation product, sensitizes human cells to UV- and BPDE34
induced killing and mutagenesis through inhibition of nucleotide excision repair.
Mutat Res. 2006, 601(1-2):125-36
13) FUTREAL PA, COIN L, MARSHALL M, DOWN T, HUBBARD T, WOOSTER
R, RAHMAN N, STRATTON MR. A census of human cancer genes. Nat. Rev.
Cancer 2004, 3: 177-83.
14) HAGMAR L, STROMBERG U, BONASSI S, HANSTEEN IL, KNUDSEN LE,
LINDHOLM C, et al. Impact of types of lymphocyte chromosomal aberrations on
human cancer risk: results from Nordic and Italian cohorts. Cancer Res. 2004
64(6):2258-2263.
15) HAUFROID V, JAKUBOWSKI M,. JANASIK B, LIGOCKA D, BUCHET J.P,
BERGAMASCHI E, MANINI P, MUTTI A, GHITTORI S, ARAND M, HANGEN
N, OESCH F, HIRVONEN A, LISON D. Interest in genotyping nad phenotyping of
drug-metabolizing enzymes for the interpretation of biological monitoring of
exposure to styrene, Pharmacogenetics 2002, 12, 691-702.
16) HECHT S.S, CARMELLA S.G, YODER A, CHEN M, LI Z, LE CH, DAYTON R,
JENSEN J, HATSUKAMI D.K, Comparison of polymorphisms in genes involved
in polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism with urinary phenanthrene
metabolite ratios in smokers, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2006, 15: 18051810.
17) HEMMINKI K, FORSTI A, BERMEJO L.J. Gene-environmental interaction in
cancer: do they exist? Ann N Y Acyd Sci, 2006a, 1076: 137-48
18) HEMMINKI K, BERMEJO L.J, FORSTI A, The balance between heritable and
environmental aetiology in human disease, Nat Rev Genet, 2006b, 7, 958-65
19) HOULSTON R: The future of association studies of common cancers☺HumGen,
2003, 112: 434-435
20) HOEIJMAKERS JH. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.
Nature. 2001, 411 (6835):366-74.
Molecular
Epidemiology
Homepage.
21) http://www.pitt.edu/~kkr/task.html,
Developed: November, 1995, Last modified: July 28, 1998. This site maintained by:
Elsa Sulc, cit.2007-09-08
22) HUSGAFVEL-PURSIAINEN K, Molecular biomarkers in studies on
environmental cancer J. Epidemiol. Community Health, 2002; 56(10): 730 – 731
23) CHEN Y, AND HUNTER DJ, Molecular epidemiology of cancer, CA cancer
journal
for
clinicians,
2005,
55;
45-54.
http://caonline.amcancersoc.org./cgi/content/full/55/1/45,.2005
24) CHRISTMANN, M.C., TOMICIC MT, ROOS, WP, KAINA B, Mechanisms of
human DNA repair: an update. Toxicology, 193, 3-34. 2003
35
25) INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER (IARC) (1994)
IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risks in Humans: Some
Industrial Chemicals, Volume 60, WHO, International Agency for Research on
Cancer
26) INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER (IARC) (2002).
IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Some
traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene, Volume
82, WHO, International Agency for Research on Cancer
27) KLIGERMAN A.D,. HU Y, Some insights into the mode of action of butadiene by
examining the genotoxicity of its metabolites, Chem. Biol. Interact. 2007, 166 , 132139.
28) McMICHAEL AJ. Invited commentary—"molecular epidemiology": new pathway
or new travelling companion? Am JEpidemiol 1994; 140: l-ll.
29) MOHRENWEISER HW, XI T, VAZQUEZ-MATIAS J, JONES IM,. Identification
of 127 amino acid substitution variants in screening 37 DNA repair genes in
humans. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002. 11:1054-64.
30) NACCARATI A, PARDINI B, HEMMINKI K, VODICKA P. Sporadic colorectal
cancer and individual susceptibility: a review of the association studies investigating
the role of DNA repair genetic polymorphisms. Mutat. Res.-Reviews, 2007, 635,
118-145
31) NORPPA H, BONASSI S, HANSTEEN IL, HAGMAR L, STROMBERG U,
ROSSNER P, BOFFETTA P, LINDHOLM C, GUNDY S, LAZUTKA J,
CEBULSKA-WASILEWSKA A, FABIANOVA E, SRAM RJ, KNUDSEN LE,
BARALE R, FUCIC A. Chromosomal aberrations and SCEs as biomarkers of
cancer risk. Mutat Res. 2006, 600(1-2): 37-45.
32) PERERA FP. Molecular epidemiology: insights into cancer susceptibility, risk
assessment, and prevention. J Natl Cancer Inst, 1996; 88: 496-509.
33) PERERA FP, WHYATT RM, JEDRYCHOWSKI W, RAUH V, MANCHESTER
D, SANTELLA RM, OTTMAN R. Recent Developments in Molecular
Epidemiology: A Study of the Effects of Environmental Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons on Birth Outcomes in Poland, Am J Epidemiol, 1998, Vol. 147,
s. 309-314
34) PERERA FP, WEINSTEIN IB, Molecular epidemiology: recent advances and
future Carcinogeneis, 2000, 3: 517-24
35) PECHLIVANIS S. PARDINI B, BERMEJO JL, WAGNER K, NACCARATI A,
VODICKOVA L HEMMINKI K, VODICKA P, FÖRSTI A. Insulin pathway
related genes and risk of colorectal cancer: INSR promoter polymorphism shows a
protective effect, Endocrine-Related Cancer, 2007, 17, 735-742
36
36) POIRIER M.C, Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nature
Rev. 2004, 4 630-637.
37) PORTA M., MALATS N, VIOQUE J, CARRATO A, SOLER M, BARBERA V,
AYUDE D, REAL FX. Incomplete overlapping of biological. Clinical and
environmental information in molecular epidemiological studies: a variety of causes
and a cascade of consequences. J Epidemiol Community Health, 2002a, 56: 734-738
38) PORTA M., MALATS N, COROMINAS JM, RIFA J, PINOL JL AND REAL FX.
Generalizing molecular results arising from incomplete biological samples.
Expected bias and Unexpected findings. Ann Epidemiol. 2002b; 12: 7-14
39) ROSSNER P, BOFFETTA P, CEPPI M, BONASSI S, SMERHOVSKY Z,
LANDA K, et al. Chromosomal aberrations in lymphocytes of healthy subjects and
risk of cancer. Environ Health Perspect. 2005, 113(5): 517-20.
40) SHIELDS PG, HARRIS CC. Molecular epidemiology and the geneticsof
environmental cancer. JAMA 1991; 266: 681-7
41) SCHULTE, PA, Molecular epidemiology: principles and Practices, San Diego,
Academic Press. 1993
42) SCHULTE PA, SWEENEY MH. Ethical considerations, confidentiality issues,
rights of human subjects, and uses of monitoring data in research and regulation,
Environ Health Perspect 1995, 103(Suppl 3): 69-74
43) THILLY,W.G. Have environmental mutagens caused oncomutations in people?
Natur Genet., 2003, 34; 255-259
44) VODIČKA P. AND. HEMMINKI K, Depurination and imidazole ring-opening in
nucleosides and DNA alkylated by styrene oxide, Chem.-Biol. Interactions, 1988a,
68, 117-126
45) VODIČKA P. AND. HEMMINKI K, Identification of alkylation products of
styrene oxide in single- and double-stranded DNA. Carcinogenesis, 1988b, 9 (9),
1657-1660
46) VODIČKA P, KOSKINEN M, ARAND M., OESCH F.AND. HEMMINKI K.
Spectrum of styrene-induced DNA adducts: the relationship to other biomarkers and
prospects in human biomonitoring. Mutat. Res. 2002, 511, , 239-254
47) P. VODICKA, M. KOSKINEN, A. NACCARATI, B. OESCHBARTLOMOWICZ, L. VODICKOVA1, K. HEMMINKI, F. OESCH, Styrene
metabolism, genotoxicity and potential carcinogenicity. Drug Metab. Rev., 2006a,
38, 1-49
48) VODICKA P., LINHART I., NOVÁK J., KOSKINEN M., VODICKOVÁ L.,.
HEMMINKI K. Alkylguanine adduct levels in urine, lungs and liver of mice
exposed to styrene by inhalation, Toxicol. Appl. Pharmacol. 2006b, 210, 1-8
37
49) VODICKA P., STETINA R., POLAKOVA V., TULUPOVA E., NACCARATI A.,
VODICKOVA L., KUMAR R., HANOVA M., PARDINI B., SLYSKOVA J.,
MUSAK L., DE PALMA G., SOUCEK P., HEMMINKI K. Association of DNA
repair polymorphisms with DNA repair functional outcomes in healthy human
subjects, Carcinogenesis, 2007 Mar;28(3):657-64
50) WEISS JM, GOODE EL, LADIGES WC, ULRICH CM. Polymorphic variation in
hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.
Mol Carcinog. 2005, 42(3):127-41
51) WILD CP, LAW GR, ROMAN E: Moleclar epidem. and cancer: promising area for
future research in postgenomic area, Mut Res, 2002, 499(1):3-12
38