docKapilární elektoforéza
download 
Stížnost Transkript
Kapilární elektoforéza
Kapilární elektromigrační metody Zdeněk Glatz Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Svensson (Rilbe) 1970 - SDS PAGE Laemmli 1975 - 2D-elektroforéza O´Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers Historický přehled CE 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1967 - Hjerten Historický přehled 1967 1974 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen Historický přehled 1967 1974 1979 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers Historický přehled 1967 1974 1979 1981 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1981 - Jorgenson Lukacsová Historický přehled 1967 1974 1979 1981 1984 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe Historický přehled 1967 1974 1979 1981 1984 1985 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten Historický přehled 1967 1974 1979 1981 1984 1985 1989 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten První komerční zařízení pro CZE Beckman 1989 - Beckman Historický přehled 1967 1974 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckmann 2003 - Projekt lidského genomu 2003 - Projekt lidského genomu Proč CE ? Výhody CE • Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry Výhody CE • Aplikační diverzita • Jednoduchá instrumentace Výhody CE • Aplikační diverzita • Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC Výhody CE • • • • • • Aplikační diverzita Jednoduchá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorku Rychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů Nevýhody CE • Koncentrační citlivost Nevýhody CE • Koncentrační citlivost • Robustnost Nevýhody CE • Koncentrační citlivost • Robustnost CE je komplementární k HPLC CZE zdroje plynová chromatografie Křemenné kapiláry kapilární chromatografie Detekční systémy zónová elektroforéza Chemie pufrů Aplikovatelnost CE Impurities 24% Small ions 11% Chiral 22% Assay 26% Identity 17% Altria KD and Kersey M, LG-CG Int., 8, April., 1995, 201-208 Teoretické aspekty CE Mobilita E - Fe + Ff + Elektrická síla Fe F = E ×Q e E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = zi × e [] Frikční síla Ff F =v× f f v = rychlost částice f(frikční koeficient) = 6π.η.r Ustálený stav E ×Q = v× f E ×Q v= f mobilita v µ= E [m-2 V-1 s-1] Iontová mobilita (limitní zředění, teplota 298 K) KATIONTY |µ0|.109 ANIONTY |µ0|.109 H3O+ Li+ Na+ K+ Tris+ β−alanin ethanolamin imidazol 362.5 40.1 51.9 76.2 29.5 36.7 44.3 52.0 OHFClNO3SO4k.mléčná k.octová MES 205.5 57.4 79.1 74.1 82.9 36.5 42.4 28.0 Odhad iontové pohyblivosti - Joklova rovnice µo = z × a −b Mr a,b = empirické konstanty Mr = relativní molekulová hmotnost Vliv iontové síly - Onsagerova rovnice µ = µo − (0.23 µo zzc + 313 . × 10 z = náboj iontu zc = náboj protiiontu −9 z)× I 1+ I Vliv teploty µ =µ T To ×[1+ 0.02× (T − To )] To = standardní teplota T = pracovní teplota Efektivní mobilita A0,A1,A2,........Ak µ0,µ1,µ2,...........µk k 1 k µ A = × ∑ ci µ i = ∑ xi µ i cA i =0 i =0 cA = celková analytická koncentrace látky A xi = molární zlomek iontu i Závislost efektivní mobility na pH pro slabou monovalentní kyselinu µA = [H ] × µ + [H ] + + K HA A pro slabou monovalentní zásadu µB = [H ] × µ + [H ] + K BH + BH Sekundární jevy při CE • Jouleovo teplo • Elektroosmóza • Difuze Jouleovo teplo 2 i E ×i = P= 2 S κ ×S P = výkon [W.m-3] S = průřez [m2] κ = vodivost [Ω-1.m-1] i = elektrický proud [A] Jouleovo teplo Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok ξ= 4πηµeo ε ξ = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy η = viskozita ε = dielektrická konstanta µeo = elektroosmotická mobilita ε veo = × Eξ 4πη Původ elektroosmotického toku Anode EOF Cathode Původ elektroosmotického toku Elektroosmotický tok Laminární tok Elektroosmotický tok v různých kapilárách Difuze c = c0 e 2 x −( σ 2) σ = 2 Dt σ2 = rozptyl D = difuzní koeficient Mody kapilární elektroforézy Módy CE Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře Výsledná mobilita částic při CZE Metody ovlivňování EOF v CZE Běžně používané elektrolyty Elektrolyt pKa’s • • • • • • • • • • • • • 2.12 pKa1 3.06 pKa1 4.75 6.15 6.80 6.90 6.90 7.20 7.55 8.30 9.24 9.50 10.40 Fosfát Citrát Acetát MES PIPES ACES MOPSO MOPS HEPES TRIS Borát CHES CAPS 7.21 pKa2 5.40 pKa2 12.32 pKa3 Separace při nízkém pH Detector response + + + ++ + Time Separace při nízkém pH Separační podmínky : 30°C, dávkování 5 sec. při 0.5psi, +13kV, 25mM NaH2PO4, upraven na pH 2.5 koncentrovanou H3PO4, 200nm, 37cm x 75µm kapilára Sodium phosphate pH 2.5, normalní kapilára +30kV Sodium phosphate pH 2.5, pokrytá kapilára +30kV Separace anorganický anionů s přímou UV detekcí Separace při vysokém pH 4 2 UV response 1 + - 5 Neutrals + 400 3 500 600 - 750 900 sec Separace při vysokém pH Separace kyselých léčiv separovaných v 15mM boratu s UV detekcí při 200 nm Změna EOF přídavkem kationtového detergentu Separace anorganických aniontů Separace anorganických aniontů 2.25 pyromellitic acid, 6.5 mM NaOH, 0.75 mM hexamethonium hydroxide, 1.6 mM triethanol- amine, pH 7Negative polarity 465 V/cm, 9 µA 56/64.5 cm id=50 µm inj: 200 mbars Temp=25°C Indirect Detection Sig: 350,60 nm Ref: 245,10 nm Separace aniontů pomocí CZE Borátová komplexace CZE v nevodném prostředí µeo = εξwall / η Nejlepšé rozpouštědla mají vysoké hodnoy ε/η SOLVENT η ε ε/η UV Cut Off voda NMF DMF DMSO Acetonitril Methanol Ethanol 0.89 1.65 0.80 2.00 0.34 0.54 1.07 80 182 36.7 46.7 37.5 32.7 24.6 89.9 110.3 45.9 23.4 110.3 60.6 23.0 191 ~ 260 ~ 260 ~ 260 195 205 205 •Selectivita - Solvatace - pH* - Rozpouštědla v různých poměrech •Účinnost - nízký proud díky nízkým dielectrickým konstantám - Rychlé separace - >350,000 •Vhodné pro soluty nerozpustné ve vodě (náhražka MEKC) •CE-MS kompatibilní A = Vodná CE B = Nevodná CE S.Hansen et al trends in analytical chem. ,15, 175, 1996 1mM Acetate @ pH* 9.3 in 50/50 MeOH/MeCN UV@ 200nm Altria KD and Bryant SM, Chromatographia, 46 1997 122-130 Non aqueous CE of inorganic anions 10mM KH Phthalate, 1mM TMAH methanol:DMF 7:3 Indirect 254nm Cl content in Azelastine HCL 8.59% theory 8.47 CE Suzuki et al J.Chromatogr.A 829 (1998( 411-415 Princip MEKC Micela a – střed – rozpustná v obou b – silně hydrofilní – nerozpustná v micele c – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi Micelární elektrokinetická chromatografie Kapacitní faktor a rozlišní v MEKC tr −1 t0 k= tr 1− t0 t0 ⎞ ⎛ ⎟ ⎜ 1− 12 ⎛ N ⎞⎛ α − 1⎞⎛ k 2 ⎞⎜ t mc ⎟ ⎟⎟⎜ ⎟⎟ R s = ⎜⎜ ⎟⎜⎜ ⎝ 4 ⎠⎝ α ⎠⎝ k 2 + 1⎠⎜ 1 + t 0 k 1 ⎟ ⎟ ⎜ t mc ⎠ ⎝ α = selektivita Separační „okno“ v MEKC pro neutrální látky Factory ovlivňující selektivitu • Typ detergenu – Různé čelní skupiny mají silný vliv (iontové interakce) – Žlučové kyseliny – Kationtové (otočení EOF) • pH – Ovlivňování ionizace • Pufr – Efekt aditiv je větší než u CZE – Organické modifikátory • Teplota – Ovlivňuje chování micel – 2ºC může značně ovlivnit separaci Používané detergenty Typ Detergent CMC (mM) Agregační číslo aniontový SDS 8.2 62 kationtový CTAB DTAB 14 1.3 50 78 neiontový Oktylglukosid Dodecylmaltosid Triton X 100 0.16 0.24 140 CHAPS CHAPSO 8 8 10 11 cholová k. deoxycholová taurocholová 14 5 10-15 2-4 4-10 4 zwitterionty žlučové kyseliny OH COONa Na cholát OH OH Zvyšuje rozpustnost solutů více než SDS K dispozici různé deriváty Možno použít spolu s methanolem, propan-2-olem 20-100mM koncentrace Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC Analysis of organic acids using low pH MECC, SDS concentration = 60mM Key to figure: AP = 4-Acetamido-phenol, NA = β-naphthoxyacetic acid (sodium salt), S = Saccharin (sodium salt hydrate), BA = Benzoic acid (sodium salt), B = Barbital (sodium salt), SA = Salicylic acid. MEKC derivativátů anilínu (a) SDS nebo (b) sodium laurylsulfoacetate surfactanty. Buffer: 0.02-M borate–phosphate buffer (pH 7.0). Detection wavelength: 240 nm. Applied voltage: 20 kV. 1, aniline; 2, o-aniline; 3, m-aniline; 4, p-aniline; 5, o-toluidine; 6, m-toluidine; 7, p-toluidine; 8, o-nitroaniline; 9, m-nitroaniline; 10, p-nitroaniline; 11, o-chloroaniline; 12, m-chloro aniline; 13, p-chloroaniline; 14, acridine orange-10-dodecylbromide. Optimalizace SDS MEKC Starting conditions - 15mM borate with 50mM SDS Small k’ Large k’ DECREASE SDS INCREASE SDS Insufficient resolution ? Lower pH, Lower voltage, Ion-pair reagent Insufficient resolution ? Organic solvents, Temperature, Electrolyte ALTERNATIVES Cationic surfactants Bile salts MIxed micelles Low pH Organic solvents, Temperature, Electrolyte Ion-pair reagent, Lower pH, Lower voltage Mikroemulsní elektrokinetická chromatografie MEEKC retentce vs LogP Valko 5 (7,1) Acetanilide Acetophenone 4 3.5 Heptanophenone 20 4 5 6 7 8 2.5 2 1.5 1 0.5 9.83 40 logP 3 Hexanophenone 60 4.5 Valerophenone 80 Phenacetine 100 5 Propiophenone 120 Butyrophenone Response logP vs migration time 9 Retention time Altria KD, J.Chromatogr.A 892 (2000) 171-186 0 0 2 4 6 migration time 8 10 Separace testovací směsi MEEKC Paracetamol Methyl paraben 4-hydroxyacetophenone Ethyl paraben Propyl paraben Naphthalene Separace směsi vitaminů Vutamíny rozpustné ve vodě a tucích - nikotinamid - riboflavin - askorbová kyselina - thiamin - vitamin A - vitamin D Chiralita –chirální separace ? Thalidomid Thalidomid Chirální separace Srovnání chirálních separací pomocí CZE a HPLC u hexabarbitalu CZE Rychlý vývoj metody Vysoké rozlišení Nízká cena reagencií Rychlost analýzy Analytické provedení HPLC Zdlouhavý vývoj metody Dlouhé doby analýzy Vysoká cena kolon Preparativní provedení Cyklodextriny • α CD - 6 glukosových zbytků • β CD - 7 glukosových zbytků • γ CD - 8 glukosových zbytků Cyklodextriny Neaturalní α β γ Chemicky derivatispvané formy jako např. methyl, hydroxypropyl Nabité cyclodextriny, amino-, sulfo-, karboxy- Sulfatovaný cyklodextrin Cyklodextriny Aplikace : nabité CD – neutrální enantiomery neutrální CD – nabité enantiomery Separace terbutaline s různými cyclodextriny Crown ethery O H O O R N + O H H O O Vhodné pro primarní aminy jako např. aminokyseliny Dextranové polymery Vancomycin Použití v chiralních CE separacích Vysoká UV absorbance Chiralní CZE při nízkém pH Ad + Ad + Al+ Ad + Al+ Ad + Ad+ Al+ Al+ Ad + Ad + Al+ Ad + Al+ Al+ Triethanolamine-fosfát BGE (pH 2.5) s α-cyclodextrinem. Detekce při 200nm Optimalizace chiralní separace při nízkém pH 15mM CD pH 2.5 Try crown ether No resolution? Primary amine ? Chiral Separation ? Increase or decrease CD Try different CD Optimize conditions No resolution? SDS MECC + CD or bile salt Chirální CZE při vysokém pH Al - Al Al Ad - Ad - - Ad - Al - Ad - Ad - Al - - EOF FLOW Al - Ad - Optimalizace chiralní separace při vysokém pH 15mM CD borax Chiral Separation ? No resolution? Try oligosaccharide Increase or decrease CD Try different CD Optimize conditions No resolution? SDS MECC + CD or bile salt MEKC pro chiralní separaci - Al - Al - - - - Al - - - Ad - - - - EOF -A - - - Ad Ad d - - Al - Optimalizaci MEKC pro chiralní separaci 15mM CD, 50mM SDS, borax Chiral Separation ? No resolution? Try bile salts Increase or decrease CD Try different CD Optimize conditions No resolution? Try mixed micelles 30 mM SDS, 100mM borate, 10mM HP-β-CD LOD of <0.06% (detection at 200nm) Noroski et al, J.Pharm.Biomed.Anal., 13, 1995, 45-52 Kapilární gelová elektroforéza Polymerní matrice pro CGE CGE fragmentů dsDNA CGE oligonukleotidů Projekt lidského genomu – sekvenace DNA CGE bílkovin v přítomnosti SDS Kapilární izoelektrická fokusace A A + A + - A A A Low pH A + + A A pI value - A - High pH - Kapilární izoelektrická fokusace CIEF EOF = 0 → pokryté kapiláry Postup : 1. Vlastní fokusace 2. Mobilizace - moblilizace EOF ≠ 0 → vzorek nanesen v celé kapiláře analyty musí projít detekční celou elektroforetická hydrodynamická bez mobilizace nepokrytá kapilára, vzorek nanášen pouze v úzké zóně na začátku kapiláry CIEF bílkovin pomocí tlakové mobilizace Kalibrační křivka IEF Kapilární izotachoforéza ITP nukleotidů Kapilární elektrochromatografie Srovnání toku u LC a CEC LC CEC CEC separace neutrálních látek Instrumentace CE Výrobci • Agilent and Beckman • 1 500 000 Kč Beckman MDQ Agilent HPCE 3D Bioanalyser Agilent 2100 Schéma zařízení pro CZE Napájecí zdroj • • • • stabilizovaný ± 30 kV 300 µA konstantní napětí nebo proud obojí polarita ochrana obsluhy Kapilára • křemenná - 25 -100 µm i.d - 350 µm o.d. • délka až 100 cm délka • polyimidové vnější pokrytí Kapilára • Id efektivní délka • L celková délka • Is „short end injection“ Detector position ld L ls Délka kapiláry Modifikace kapiláry kovalentní Si - O - Si - R Si - C - R adsorbované celulosa, PEG, PVA, PEI dynamické detergenty hydrofilní polymery kvarterní aminy extrémy pH vysoká I pH 4 - 7 pH 2 - 10 Dávkování Hydrodynamické Elektrokinetické Elektromigrační disperze Analýza kationů nepřímou detekcí Detekce Spektrofotometrická detekce DAD detekční systém Lineární detekční rozsah Zvýšení citlivosti detekce Zvýšení citlivosti detekce Agilent Flow cell Rozlišení zón Multireflekční cela Fluorescenční detekce Nepřímá detekce FS 1. Empty capillary FS 0 0 3. Separation FS 0 2. Filled capillary Nepřímá detekce Separace anorganických aniontů Indirect UV detection at 254nm Separace organických aniontů 0 mins 5 mins 27cm x 75micron, 3.0 sec injection, 0.5mM TTAB/5.0mM phthalate/50mM MES pH5.2, 30C, -3kV CZE-MS Schéma CZE-ESI-MS CZE-ESI-MS analýza peptidů Zvýšení citlivosti detekce Efekt složení vzorku na separaci Stacking Transient ITP Transient ITP Transient ITP Zakoncentrování pomocí IEF Speciální aplikace Multiplex CE instrument 1997 µCE Příprava mikrochipů UV Light Mask PDMS PDMS Channel Photoresist Mold Silicon wafer Požívané materiály • Sklo – První použitý materiál – Dobře známé vlastnosti – Složitá konstrukce • Polymery – – – – levnější Méně křehké Více možností chemismu Nepříliš dobře charakterizované Klasická CZE Absorbance (mAu) 2.0 A Cr 1.5 UA 1.0 ? Cn 0.5 0.0 EDTA -0.5 -1.0 2 6 8 10 12 Time (min) B 35 Absorbance (mAu) 4 Cr 30 25 20 UA Cn 15 10 5 0 0 5 10 15 Time (min) 20 25 Microchip CZE 1.2 uric acid Current (nA) 1.0 0.8 0.6 unknown 0.4 0.2 0.0 0 10 20 30 Time (s) 40 50 Bioanalyser Agilent 2100 LIF - imunostanovení LIF - imunostanovení Využití CE pro analýzu biologicky aktivních látek v léčivých rostlinách a tělních tekutinách • Hořčiny – zeměžluč, hořecMEKC Glatz, Z. et al. J.Liquid Chromatogr. Rel. Technol., 2000, 23, 1831. • Lignany – schizandra činskáCEC,MEKC Kvasničková, L. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s. 265. Štěrbová, H. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 253. • Flavonoidy – artyčokMEKC Ševčíková, P. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 249. Využití CE v klinické diagnostice • Thiokyanát – sliny, močCZE Glatz, Z. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s. 273. • Cystein – močMEKC Ševčíková, P. et al. J. Sep. Sci., 2003, 26, s. 734. • Homocystein – plasmaMEKC Ševčíková, P. et al. J. Chromatogr. A, 2003, 990, s. 197. • GSH – erythrocytyMEKC Mašlaňová H., et. al. J. Chromatogr. A, 2000, 990, s. 197. Využití CE pro separaci microcystinů CEC separace extraktu sinic Zeisbergerová, M. et al. J. Chromatogr. B 2006, 841, 140. Využití CE pro separaci bakterií CZE separace bakterie Lactobacillus acidophilus DAD1 A, Sig=214,10 Ref=off (BACTERIA\05XII004.D) SEMIPREPARACE mAU 800 Dávkovaná kultura 700 600 500 400 300 Separovaná frakce 200 100 0 2 4 6 8 10 12 Šnajdrová, L. et al. Chemické Listy, 2002, 96, 6s. 432. 14 16 18 min Využití CE při studiu enzymů Studium enzymových reakcí pomocí CE „Pre-capillary“ „On-capillary“ Výhody CE Kapilára jako reakční prostor Studium enzymových reakcí pomocí CE „Pre-capillary“ provedení : - kapilára je používána pouze pro separaci a detekci - nutná manipulace mezi enzymovou reakcí a separací Kinetické stanovení glutathion S-transferasa Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357. „End point“ stanovení cytochrom P450 2C9 Konečný, J. et al. Electrophoresis, 2007. 28, 1229. Studium enzymových reakcí pomocí CE „On-capillary“ provedení : - kapilára je navíc využita i jako reakční prostředí - stanovení je automatizováno – dávkování, smísení, inkubace, separace, detekce ⇒ CE Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza Electrophoretically Mediated MicroAnalysis EMMA J. Bao, F.E. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolání reakce přímo v kapiláře EMMA - kontinuální mód A Substrate filled capillary Detection window - + + E P - EMMA – zonální mód Detection window B - + + S E P - EMMA – zonální mód Výhody : ¾Menší spotřeba vzorků – enzym, substráty, inhibitory ¾Vyhodnocování EMMA – vyhodnocení G6PDH Glu-6P + NAD+ Kontinuální mód B.J. Harmon et al.,J. Chromatogr. A 726, 193 (1996). 6P-Glu + NADH Zonální mód E.S .Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397, 183 (1999). EMMA – využití ¾ Enzymové systémy • Aktivita enzymů • Koncentrace substrátů a inhibitorů • Michaelisovy a inhibiční konstanty ¾ Neenzymové systémy • GSH, HCys, Cys, DTT • Ca(II) • Gentamycin a kanamycin • Kreatin • Cr(VI) a Co(II) S. NOVÁKOVÁ, S. VAN DYCK, A. VAN SCHEPDAEL, J. HOOGMARTENS & Z. GLATZ* REVIEW: Electrophoretically Mediated Microanalysis J. Chromatogr. A 1032, 173 (2004). S. VAN DYCK, E. KAALE, S. NOVÁKOVÁ, Z. GLATZ, A. VAN SCHEPDAEL* & J. HOOGMARTENS REVIEW: Advances in Capillary Electrophoretically Mediated Microanalysis. Electrophoresis 24, 3868 (2003). Studium enzymů pomocí CE ? (pre-capillary versus on-capillary) Rhodanasa (EC 2.8.1.1) CN- + S2O32- → SCN- + SO32- Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity Volba separačn, ích podmínek CN- + S2O32- → SCN- + SO32- 100 mM β-alanin - HCl, pH 3.5 nízký EOF CN- = HCN rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity Stanovení aktivity 45 40 35 S2O32- mAU PEAKAREA 30 25 20 15 200 10 SCN- 5 0 0 5 10 15 20 25 30 TIME [min] 150 15 min 12 min 100 50 0 9 min 6 min 3 min 0 min 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 min rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity Charakterizace enzymu z A.ferrooxidans EFFECT OF TEMPERATURE ON RHODANESE REACTION EFFECT OF pH ON RHODANESE REACTION 100 C A - MES BUFFER B - HEPES BUFFER C - TRIS BUFFER D - BORATE BUFFER 100 80 REL.ACTIVITY [%] RELATIVE ACTIVITY [%] 80 D 60 B 60 40 40 20 A 20 0 0 0 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 10 20 30 40 50 60 TEMPERATURE [oC] pH Stanovení pI 6.5 (chromatofokusace) Stanocení MW 22 000 (gelová permeační chromatografie) Bouchal, P. et al. Folia Microbiol, 2001, 46, 385. rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Volba separačních parametrů Separace anorganických aniontů (S2O32- , SCN-) probíhá nejlépe při nízkém pH základního elektrolytu ⇒ eliminace EOF pH optimum rhodanasy: 8.5 Kombinace metody EMMA s "partial filling technique" rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry Základní elektrolyt Parametr Hodnota 100 mM časů β-alanin – 0,23 HCl (pH Přesnost migračních % (n=10) Dávkování Přesnost ploch píků 3,88 % (n=10) 2. 3. 1. 25 mM HEPES pufr (pH 8.5) : 50 mbar/4s Rhodanasa ve 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) : 50 mbar/4s Substráty ve 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) : 50 mbar/4s 4. - 25 mM HEPES (pH 8,5) nástř 3.5) 25 mM HEPES pufr (pH 8.5) : 50 mbar/4s Substráty v 25 mM HEPES (pH 8,5) Rhodanasa v 25 mM HEPES (pH 8,5) 25 mM HEPES (pH 8,5) Separační napětí 18 kV (negativní polarita) + Detekce rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů -1 -0,75 -0,5 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 -0,25-0,002 0 -0,004 -0,006 0,8 0,7 0,6 0,25 0,5 0,75 1 1,25 2 mM KCN 0,4 1/KM(CN-) 0,3 0,2 0,1 -0,6 5 mM KCN -0,4 -0,2 -0,1 0 0,2 0,4 0,6 -0,2 1/ [KCN] (l/mmol) 10 mM KCN KM (CN-) = 7.60 mM S2O32- KM (S2O32-) = 13.02 mM E SCN- E•S2O3 2SO32- y = 0,5839x + 0,0768 1/KM(S2O32-) 0 1/ [Na2S2O3] (l/mmol) 1 mM KCN 0,5 úsek na ose x 1/ plocha píku (mAU*s) Stanovení Michaelisových konstant Km ES CN- 0,8 1 1,2 Sulfotransferasa (EC 2.8.2.1) ¾cytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) ¾membránově vázaná - sulfatace glykoproteinů sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Reakce O- O S NH2 O O O N O- N P CH2 N O O HO P -O O HO OH O N SULT1A1 + NO2 OH O 4-Nitrophenol Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) ~1 mg 100 € O- N O CH2 N O O- N P O S O O N + HO P -O PAPS 274 nm NH2 O OH NO2 O PAP 4-Nitrophenyl sulfate Velmi silný inhibitor reakce KI = 0.4 µM Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Dávkování a inkubace Krok Zóna Tlak pi (psi) Čas (s) Napětí (kV) 1. Dávkování PAPS PAPS 0.5 5 / / / 60 15 3. Dávkování S 4-NP 0.3 5 / 4. Dávkování E SULT1A1 0.3 5 / 5. Smísení a enzymová reakce / / 60 5 6. Inkubace / / 120 0 7. Separace / / 300 10 2. Předseparace od PAPS - PAP PAPS nástřik vzorku P + detekce sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Stanovení Michaelisovy konstanty pro 4-nitrofenol 2.5 µM pNP 1.5 µM pNP 1 µM pNP 0.5 µM pNP 0.3 µM pNP 0.2 µM pNP 0.1 µM pNP KM = 0.8 µM
Podobné dokumenty
Prezentace aplikace PowerPoint
M. HEJDOVÁ, E. ČERNOŠKOVÁ, R. TODOROV, Z. ČERNOŠEK, J. HOLUBOVÁ
Příprava vrstev na bázi TEOSu procesem sol-gel a jejich funkcionalizace .................29
B. HOLUBOVÁ, Z. ZLÁMALOVÁ CÍLOVÁ, I. KUČE...
Magnetické nanočástice v medicíně
- Takto magneticky označený materiál je odseparován z nativního prostředí pomocí gradientu
vnějšího magnetického pole
Imunomagnetická
Imunomagnetic
ká stanovení (magnetické částice jsou použity pro...
vod_do_studia
Schopnost atomu přitahovat si vazebné elektrony závisí na jeho postavení v periodické tabulce ( roste zleva doprava a zdola nahoru). Kvantitativně vyjadřujeme míru polarity vazby dipólmomentem µ ( ...
Pacienti si většinou přejí zkvalitnit svůj život
Azelastin dokonce zabírá i u pacientů, u kterých nevedla k žádoucí úlevě
antihistaminika v tabletách ani kortikosteroidy ve spreji (non-respondery)18.
Díky Azelastinu není tedy nutné stupňovat léčb...
Stanovení celkové k ní celkové kyselosti nápojů potenciometrickou t
ní celkové k
kyselosti nápojů potenciometrickou
metrickou titrací
t
Princip metody
odu ekvivalence
ekvivale
- vizuální a
U acidobazických titrací se využívají dva druhy indikace bodu
instrumentální...
Přehled stanovení lipofilních vitaminů v potravinách a
polárních látek z extraktu, se může úspěšně vyřešit předřazením předkolony se stejnou náplní
jako má analytická kolona.
Při separaci na reverzní fázi se používá jako stacionární fáze nejčastěji okt...
Metody - proteiny, NK
• preparativní elektromigrační metody – elektroforéza
• krystalisace
Analytické postupy – včetně metod separačních
• elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku,
• spektrální metody
abso...
správné odpovědi ve formátu PDF
3 Jaká je celková plocha registrovaných vinohradů v ČR?
a) 12 981 ha
b) 13 981 ha
c) 18 981 ha - přesné odpovědi 18 700 nebo 19 200 ha dle pohledu statistiky
d) 55 981 ha
4 Jaký trestný čin spáchá ...
![Web of Science [5.14] - Export Transfer Service](http://s1cz.doczz.net/store/data/000004365_1-ed4dbd9797b85bc1741def34f7747d28-70x70.png "Web of Science [5.14] - Export Transfer Service")
