Pro diagnostické poušití in vitro Kód vđrobku: FS218.A FS218.1

8
8.1
OPIČÍ VAJEČNÍK
SUBSTRÁTOVÁ SKLA PRO IFA
8.1.1
Monkey ovary 1x 5-well slide nebo Monkey ovary 10x 5-well slide
(opičí vaječník – 1x 5-jamkové sklo, nebo 10x 5-jamkové sklo).
Pro diagnostické použití in vitro
8.1.2
1 x návod k použití.
8.2
Další potřebné materiály
Kód výrobku: FS218.A
FS218.1
8.2.1
Tlumivý roztok PBS pro ředění vzorků a promývání.
8.2.2
Láhev na tlumivý roztok PBS.
8.2.3
Mikropipety a špičky na jedno použití pro nanášení pacientských
vzorků.
8.2.4
Vlhká komůrka pro inkubační kroky (např. komůrka s příchytnými
magnetickými pásky („Magnetic staining chamber“), kódové označení
BD010).
8.2.5
Fluorescenční mikroskop s excitačním filtrem 495nm a bariérovým
filtrem 515nm.
8.2.6
Plastová střička pro počáteční opláchnutí skel PBS.
8.2.7
Další složky lze objednat od firmy The Binding Site: PBS (CON 3.3),
negativní kontrola (CON 92), pozitivní kontrola pro steroidogenní
buňky (FA168), protilátka proti lidskému IgG (H+L) vysycená opičími
sérovými proteiny – konjugát s FITC (FA003.M), 1% Evansova modř
(CON 93) a montovací médium (CON195).
8.3
Pracovní postup testu
Vyrobeno společností:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Telefon: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
POUŽITÍ
Řezy opičího vaječníku jsou určeny pro nepřímou imunofluorescenci (IFA)
a slouží ke screeningu cirkulujících sérových protilátek proti steroidogenním
buňkám.
2
SOUHRN A VÝKLAD
Autoprotilátky proti steroidogenním buňkám se váží na cytoplazmatické antigeny
buněk tvořících steroidy v Leydigových buňkách varlete, thékálních buňkách
vaječníku, v placentě a kůře nadledvin. Tyto IgG protilátky se vyskytují u pacientů
s Addisonovou chorobou a u některých pacientů s poruchou vaječníků nebo
varlat a/nebo s přidruženým hypoparathyreoidismem (1-3).
3
PRINCIP
Tato substrátová skla jsou využívána v metodě nepřímé imunofluorescence, kdy
jsou pacientské vzorky a příslušné kontrolní vzorky inkubovány s tkáňovými řezy.
Nenavázané protilátky se odmyjí a potom jsou aplikovány příslušné konjugáty
značené fluoresceinem. Nenavázaný konjugát se odmyje stejně jako
v předešlém kroku. Substrátová skla se vyhodnocují pod fluorescenčním
mikroskopem, pozitivní vzorky poskytují jablkově zelenou fluorescenci, která
odpovídá oblastem řezu, kde došlo k navázání autoprotilátky (4).
4
Kontrola jakosti
Při každém testování vzorků je nutné vždy použít pozitivní
a negativní kontrolní vzorky.
8.3.1
Montovací médium: Vyjměte montovací médium z lednice tak, aby
před použitím dosáhlo laboratorní teploty (18-28ºC).
8.3.2
Ředění pacientských vzorků
Screening: Pacientské vzorky řeďte 1/5 přidáním 40µL séra ke
160µL tlumivého roztoku PBS.
Titrace: Vzorky, které byly pozitivní při screeningu, nařeďte
geometrickou řadou tlumivým roztokem PBS (např. 1/10, 1/20, 1/40
a 1/80 apod.). Příklad: Pro přípravu ředění 1/10 použijte 100µL
vzorku ředěného 1/5 a smíchejte se 100µL tlumivého roztoku PBS
(opakujte pro další ředění).
8.3.3
Substrátová skla. Před tím, než vyjmete substrátová skla
z alobalových sáčků, nechejte je vytemperovat na laboratorní teplotu
(18-28°C). Skla vhodným způsobem označte, umístěte do vlhké
komůrky a do příslušných jamek přidejte po jedné kapce pozitivní a
negativní kontroly. Do zbývajících jamek přidejte 50-100µL
naředěných pacientských vzorků.
8.3.4
Inkubace substrátových skel. Inkubujte skla 30 minut ve vlhké
komůrce při laboratorní teplotě (18-28°C).
8.3.5
Promývání pomocí PBS. Vyjměte skla z vlhké komůrky a krátce je
opláchněte proudem PBS ze střičky. Nestříkejte přímo na jamky. Skla
umístěte do držáku a ponořte je do PBS a třepejte nebo míchejte po
dobu 5-10 minut.
8.3.6
Přidání konjugátu s fluoresceinem. Odklepněte přebytek PBS
a osušte plochu mezi jamkami. Skla vraťte do vlhké komůrky
a každou jamku okamžitě převrstvěte kapkou vhodně naředěného
fluoresceinového konjugátu. NENECHÁVEJTE JAMKY PRÁZDNÉ
DÉLE NEŽ 15 VTEŘIN. Zaschnutí substrátu významně ovlivňuje
výsledky. Použití konjugátu vysyceného opičími sérovými proteiny
(např. FA003.M) výrazně zdokonaluje výsledky.
8.3.7
Inkubace skel. Skla inkubujte 30 minut ve vlhké komůrce při
laboratorní teplotě (18-28°C) v temnu.
8.3.8
Promytí v PBS. Skla opět promyjte způsobem popsaným v bodě
8.3.5. VOLITENÉ DOCÍLENÍ KONTRASTU VYBARVENÍ: Dříve, než
skla ponoříte do PBS, přidejte 2-3 kapky 1% roztoku Evansovy modři
na 100mL PBS.
8.3.9
Montování preparátu. Po uplynutí promývací doby vyjměte jedno sklo
z lázně. Rychle osušte plochu kolem jamek a do každé jamky přidejte
kapku montovacího média. Pozorně přikládejte substrátové sklo ke
krycímu sklíčku tak, aby nedošlo ke vzniku bublin. Pokud se bubliny
vytvořily, nesnažte se je odstranit. Přebytek média kolem okrajů
krycího sklíčka otřete.
8.3.10
Prohlížení skel pod fluorescenčním mikroskopem. Hotová skla lze
skladovat při 2-8°C v temnu až po dobu 3 dnů, aniž by došlo
k signifikantní ztrátě fluorescence.
REAGENCIE
Řezy opičího vaječníku na 5 jamkových sklech jednotlivě balených v alobalovém
sáčku s vysoušedlem.
5
UPOZORNĚNÍ
Pro testování všech potenciálně infekčních vzorků tímto výrobkem je nutné
zavést správné metody používání a likvidace materiálu. Tyto postupy mohou
provádět pouze pracovníci, kteří byli v těchto metodách odpovídajícím způsobem
školeni.
6
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
Neotevřená skla je nutné skladovat při teplotě 2-8°C a lze je používat až do
uvedeného data exspirace. NEZAMRAZUJTE. Jakmile jsou skla vyjmuta
z alobalového sáčku, je nutné je okamžitě použít.
7
Dodávané materiály
FS218.A, FS218.1
Czech
1
PROVEDENÍ TESTU
ODBĚRY VZORKŮ
Vzorky krve je třeba získat odběrem ze žíly, krev nechat přirozeně zkoagulovat
a sérum oddělit co nejdříve, aby nedošlo k hemolýze. Sérum lze skladovat při
teplotě 2-8°C po dobu až 7 dnů před testem (7), nebo pro účely delšího
skladování je séra třeba rozplnit po malých množstvích a skladovat při teplotě
-20°C nebo nižší. Nikdy NEZAMRAZUJTE a nerozmrazujte séra více než
jedenkrát. Vyhněte se použití lipemických, hemolytických nebo mikrobiálně
kontaminovaných sér vzhledem k tomu, že může dojít ke snížení titru nebo
výskytu nejasných obrazů imunofluorescentního barvení.
Insert Code : HIN044.Cz, Version : 1 April 2007, Page 1 of 2
9
9.1
VÝSLEDKY
Kontrola jakosti
Vzorek séra obsahující autoprotilátky proti steroidogenním buňkám ve vaječníku
by měl poskytovat jasné jablkově zelené fluorescentní zbarvení několika typů
buněk. Nejčastěji je pozitivní zbarvení identifikováno jako lem z vnitřních
thékálních buněk obklopujících folikuly.
Negativní kontrola musí vykazovat matně zelené zabarvení všech tkání bez
rozeznatelné fluorescence.
Pokud kontrolní vzorky neposkytují výše popsané obrazy, test je neplatný a je
nutné ho zopakovat.
9.2
Interpretace výsledků
Na barevných fotografiích v literárních odkazech č. 5 a 6 si prohlédněte příklady
imunofluorescentního zbarvení. Výsledky se vyhodnocují jako pozitivní nebo jako
negativní.
Poznámka: Každá laboratoř si musí stanovit mez, od které jsou pozitivní
výsledky z klinického hlediska významné.
10
OMEZENÍ POSTUPU
10.1
Citlivost stanovení bude ovlivněna zdrojem světla, filtry a optikou
různých typů fluorescenčních mikroskopů. Na funkci mikroskopu má
velký vliv správná údržba, zejména vycentrování rtuťové výbojky
a výměna výbojky po doporučené době.
10.2
Vzhledem k tomu, že substance krevních skupin jsou exprimovány
některými buňkami ve vaječníku, budou séra obsahující protilátky
proti krevní skupině A nebo proti krevní skupině B poskytovat určité
fluorescentní barvení (6). Tento fluorescentní obraz je odlišný od
obrazu, který poskytují protilátky proti steroidogenním buňkám.
10.3
Vhodnost používání činidel pro IFA od jiných výrobců nebyla
stanovena, ale používání s těmito reagenciemi nemusí být nutně
vyloučeno.
10.4
Tento test sám o sobě nemůže sloužit ke stanovení diagnózy. Je
třeba vzít v úvahu všechny ostatní faktory včetně anamnézy pacienta
a výsledků dalších sérologických nebo bioptických testů.
11
LITERATURA
1.
Sotsiou F et al. (1980). Immunofluorescence studies on
autoantibodies to steroid-producing cells and to germline cells in
endocrine disease and infertility. Clin. Exp. Immunol. 39, 97-111.
2.
Elder M, et al (1981). Gonadal autoantibodies in patients with
hypogonadism and/or Addison's disease. J. Clin. Endocrinol. Metab.
52, 1137-1142.
3.
Ahonen P et al (1987). Adrenal and steroidal cell antibodies in
patients with autoimmune polyglandular disease type I and risk of
adrenocortical and ovarian failure. J. Clin. Endocrinol. Metab. 64,
494-500.
4.
Weller T H & Coons A H (1954). Fluorescent antibody studies with
agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
5.
Bradwell A R et al (1997). Atlas of autoantibody patterns on tissues.
Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham UK.
6.
Bradwell A R et al (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns.
Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham UK.
7.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed.
A. Milford Ward, Joanna Sheldon, G.D. Wild. Publ. PRU Publications,
Sheffield. 14.
12
12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6
12.7
12.8
12.9
12.10
12.11
12.12
SOUHRN PROVEDENÍ TESTU
Vytemperujte montovací médium na laboratorní teplotu.
Nařeďte PBS destilovanou vodou.
Nařeďte pacientská séra 1/5 pomocí PBS.
Vytemperujte substrátová skla na laboratorní teplotu (18-28°C).
Do příslušných jamek naneste 50µL pozitivního a negativního
kontrolního vzorku a naředěná pacientská séra.
Inkubujte ve vlhké komůrce po dobu 30 minut.
Promývejte v PBS po dobu 5-10 minut.
Okolí jamek osušte a ihned převrstvěte každou jamku kapkou
konjugátu.
Inkubujte stejným způsobem jako v bodě 12.6.
Promývejte stejným způsobem jako v bodě 12.7.
Montujte.
Skla prohlížejte pod fluorescenčním mikroskopem.
Insert Code : HIN044.Cz, Version : 1 April 2007, Page 2 of 2