BOT_OBMSB_2_cast - isb

CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE
LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB
Vyučující:
Zuzana Trojanová (24.-26.2.2012)
Michaela Sedlářová (9.-11.3.2012)
Barbora Mieslerová (23.-25.3.2012)
+ Anna Zedková (laborantka)
Podmínky k udělení zápočtu:
Protokoly
Zápočtový test
– termíny dle domluvy s vyučujícími
Mikrobiologické předměty a
vybavení mikrobiologické laboratoře
Katedry botaniky PřF UP v Olomouci
jsou inovovány v rámci projektu
OPVK
„Zvyšování konkurenceschopnosti
studentů oboru botanika a učitelství
biologie“
CZ.1.07/2.2.00/15.0316
http://isb-up.cz
Sobota
Hodnocení
Mikrobiologický rozbor pitné vody –
přeočkování
Hodnocení neděle
Přeočkování neděle
Srovnání účinnosti dezinfekčních
prostředků
Neděle
Mikroorganismy v půdě
Stanovení citlivosti mikroorganismů na
antibiotika
Neděle
Průkaz bakterií na povrchu kůže člověka
- vyhodnocení
Kultivace mikroorganismů ve „visící
kapce“
odpoledne
Izolace mikroorganismů – křížový roztěr
Neděle
Barvení mikroorganismů, mikroskopické
sledování mikroorganismů
-
Bakterie mléčného kvašení
-
MIKROBIOLOGICKÝ
ROZBOR PITNÉ VODY
přenos 1 ml vody na
agarovou plotnu
filtrace 100 ml vody
přes membránový filtr
ENTEROKOKY
Slanetz-Bartley
agar 37°C
(44-48 hod)
KOLIFORMNÍ B.
a E. COLI
TTC agar s
tergitolem 7
36-37°C (24- 48 hod)
přeočkování
červenohnědých
kolonií
žluč-aeskulin-azidový
agar (BEA), 44°C 48 h
PSYCHROFILNÍ B.
MEZOFILNÍ B.
MasoPeptonový
Agar 22°C
(do 72 h)
MasoPeptonový
Agar
36-37°C
(24-48 h)
přeočkování
žlutých kolonií
TryptofanSojový Agar
36°C, až 24 h
oxidázový
test
průkaz E. coli
indol
3. ÚKOL - MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY
Cíl úkolu:
Prokázat přítomnost bakterií obecného a fekálního znečištění pitné vody
Pomůcky:
TSA a TSB médium
Provedení:
1. Vyhodnocení koliformních bakterií na TTC agaru s tergitolem 7 (počet
žlutých KTJ na 1 ml). Narostlé kolonie přeočkujeme:
A. na neselektivní TSA (36°C, až 24 hodin) - oxidázový test
B. do neselektivního TSB (36°C, až 24 hodin) - test na E. coli
2. Vyhodnocení mezofilních a psychrofilních bakterií (tvar a počet KTJ v 1 ml
vody)
4. TTC půda s tergitolem 7 - kultivace při teplotě 36+2°C 24 hod
- stanovení KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ a ESCHERICHIA COLI
Hodnotíme počet žlutých (okrových) kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar
Po kultivaci membránového filtru se jako laktóza pozitivní bakterie počítají
všechny charakteristické kolonie (bez ohledu na velikost), které vykazují
tvorbu žlutého zbarvení média pod membránovým filtrem.
Koliformní bakterie na TTC agaru s Tergitolem
Pokud vyrostly nějaké kolonie, jsou přeneseny křížovým roztěrem na
neselektivní Tryptofan-Sojový agar (TSA), kultivace při 36°C 24-48h
Bacillus
Charakteristika rodu
Vegetativní buňky rodu Bacillus jsou aerobní, peritrichní tyčinky, rovné
s oblým nebo hranatým zakončením a poměrně velkých rozměrů: (0,5 x
1,2μm) až (2,5 x 10μm). Tvorba katalasy.
Je to rod grampozitivní
Buňky se mohou vyskytovat samostatně nebo tvoří řetízky o počtu jednotek
až stovek
Významný taxonomický znak
celé čeledi Bacilliaceae - tvorba jedné
endospory, která se vyznačuje velkou odolností k vysokým teplotám, jedům,
zářením a jiným nepříznivým podmínkám.
Pro tvorbu endospor u rodu Bacillus je absolutně nezbytná přítomnost
kyslíku. Spory jsou obvykle cylindrické, elipsoidní nebo sférické, ale je možné
se u některých kmenů určitých druhů setkat i s tvarem ledvinovitým. Umístění
spory v mateřské buňce (sporangiu) a zda mají spory vegetativní buňky větší
šířku než vegetativní buňka (tj. zda je sporangium zduřelé) či ne je typické pro
každý druh.
Rod Bacillus je rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený.
Zástupci mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny, mají bohatou
enzymatickou výbavu
- aktivní amylolytické enzymy, které štěpí škrob
- pektolytické enzymy, které štěpí rostlinné pektiny
- velmi aktivní proteolytické enzymy, takže se uplatňuje při
aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin.
Kingdom:
Phylum:
Class:
Order:
Family:
Genus:
Bacteria
Firmicutes
Bacilli
Bacillales
Bacillaceae
Bacillus
Řada druhů produkuje antibiotika polypeptidové povahy, z nichž některá
se pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově (např. bacitracin).
Určité druhy slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasy
získané z Bacillus subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu
proteinasy se používají především do pracích prostředků.
Bacillus cereus - Gramovo
barvení
Významné druhy rodu Bacillus
Bacillus anthracis
Je známá především jako původce onemocnění anthrax, v přírodě je to
však půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie
patogenem býložravých savců, nákazy u člověka jsou zaznamenávány
především v rozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použití
této bakterie v bioterorismu.
Anthrax na obarvené
mikrofotografii v slezinové tkáni
Bacillus cereus
β- haemolytická bakterie, která může způsobovat onemocnění z potravin.
Onemocnění vzniká po požití kontaminovaných potravin
enterotoxinogenním kmenem a z kontaminovaných kosmetických přípravků,
či očních kapek.
Průjmová forma (8-24 hpi) se spojuje s konzumací masových pokrmů a
omáček a je podobná otravě, kterou vyvolal Clostridium perfringens.
Emetická fáze začíná 1 – 6 hodin po požití kontaminované potravy a je
dávána do souvislosti s požitím rýžových pokrmů a těstovin. Podobnost
s otravou, kterou způsobil Staphylococcus aureus.
Převážně se vyskytuje
v půdě, ve vodě a na
rostlinách.
Kolonie Bacillus cereus na
krevním agaru
Bacillus thuringiensis
obsahuje tzv. cry toxiny, které mají insekticidní účinky na některé skupiny
hmyzu a proto se užívá k produkci pesticidů a také geneticky
modifikovaných (transgenních) rostlin.
Bacillus
thuringiensis
Bacillus subtilis
běžně nacházený v půdě. Není považován za humánního patogena; může
kontaminovat potravu, ale zřídka způsobuje jedovatost potravin.
B. subtilis produkuje proteolytický enzym subtilisin. Spory mohou přežívat
teplo, které se používá při úpravě potravin, je zodpovědný za vznik
provázkovitosti v chlebovém těstě – pevná, provázkovitá konzistence která
je dána produkcí dlouhořetězových polysacharidů.
Kolonie Bacillus subtilis na
médiu
Bacillus subtilis
barvený na endospory
B. subtilis, syn. B. atrophaeus – cíleně používaný ke zkoušení
desinfekčních přípravků .
7. ÚKOL - Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků
CÍL: Určit nejúčinější dezinfekční prostředek
POMŮCKY: roztok desinfekčního prostředku, suspenze sporulujících
mikroorganismů – Bacillus subtilis, Pasteurova pipeta, zkumavky, tekuté
médium /Masopeptonová půda/, termostat, skleněné pipety 10 ml, násadec
na pipety
Desinfekční prostředky: 10% Ajatin, 10% SAVO, 10% Incidur, 10%
Chloramin
PROVEDENÍ: Zkumavky popíšeme pořadovými čísly 1-5, poslední
zkumavka je označena K jako kontrola.
Ředění provedeme podle schématu
A1
A2
A3
A4
A5
K
1% (9ml média a 1 ml 10% roztoku desinfekce)
0,1% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A1)
0,01% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A2)
0,001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A3)
0,0001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A4)
kontrola (10 ml média)
Každou zkumavku naočkujeme 5 kapkami sporové suspenze Bacillus
subtilis a zkumavky umístíme do termostatu při 37°C po dobu 24 hod.
Mikroorganismy v půdě,
celulolytické bakterie
MIKROORGANISMY V PŮDĚ
Půda je jedním z přirozených stanovišť mikroorganismů. Bakterie se
vyskytují v půdě ve velkém množství i počtu jedinců.
Mikroorganismy jsou rozhodujícím faktorem při vzniku půdy,
ovlivňuji půdní strukturu, účastní se rozkladu organické hmoty.
Produkuji řadu látek prospěšných pro rostliny (vitamíny, růstové
látky), některé fixují vzdušný dusík.
Jsou důležitými články v koloběhu uhlíku (Myxococcus,
Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium), dusíku
(Azotobacter, Clostridium), síry (Thiobacillus), železa, manganu.
Výskyt bakterii v půdě je dán množstvím živin a ostatními faktory
prostředí (vlhkost, teplota, kyselost).
Některé mikroorganismy se vyskytují v půdě
přirozeně, jiné pouze v přítomnosti dostatečného množství živin.
KLASIFIKACE PŮDNÍCH BAKTERIÍ
1. Autochtonní – přirozené půdní organismy, jsou po celý rok
zastoupeny v relativně konstantním počtu
Pseudomonas
Agrobacterium
Corynebacterium
Mycobacterium
Nocardia
Autochtonní druhy - druhy mikroorganismů osídlující dané stanoviště od
počátku.
Zymogenní druhy - druhy, jejichž přítomnost závisí na aktuálně zvýšené
koncentraci živin nebo dodání zvláštních látek (taky se označují jako
allochtonní).
2. Zymogenní – metabolicky aktivní druhy
Vyskytují se ve vyšším počtu jen tehdy, je-li dostatečná zásoba
živin. Vyznačují se mohutnou metabolickou aktivitou a podílejí se
na procesech mineralizace půdy, zajišťují koloběh jednotlivých
prvků v biosféře.
Bacillus
Mycobacterium
Pseudomonas – některé druhy
Flavobacterium – některé druhy
Enterobacter - některé druhy
Aeromonas
sinice – Nostoc, Anabaena
3. Patogenní bakterie – baktérie patogenní pro rostliny nebo
živočichy včetně člověka, do půdy se dostávají sekundárně z
různých zdrojů a mohou v půdě přežívat značnou dobu.
Kontaminují půdu, nemnoží se zde, přežívají ve formě endospory.
Bacillus anthracis
Pseudomonas aeruginosa
Erwinia
Clostridium tetani
Agrobacterium
Pseudomonas
Bakterie tyčinkovitého tvaru, gram-negativní, jeden nebo více polárních
bičíků, aerobní nebo fakultativně anaerobní, nesporogenní, pozitivní
katalázový test. Některé z nich jsou fluoreskující. Nejznámější druhy jsou P.
aeruginosa (příležitostný lidský patogen); P. syringae (rostlinný patogen); P.
putida (půdní druh); P. fluorescens (promotor růstu rostlin).
Pseudomonas aeruginosa – oportunní lidský patogen. Pouze ojediněle
vyvolává primární infekce, může však napadnout jakoukoliv tkáň nebo
orgán (způsobuje infekce močových nebo dýchacích cest, gastrointestinální
a oční infekce atd).
Pseudomonas aeruginosa může vyvolávat
infekce ran
Agrobacterium
Rod gram negativních bakterií, které používají horizontálního přenosu genů, a
tvoří nádory na rostlinách. V současné době mnoho druhů je reklasifikováno
do rodu Rhizobium. Nejznámější je druh A. tumefaciens tvořící nádory na
kořenech rostlin. Zástupci tohoto rodu mohou způsobovat humánní infekce u
pacientů s oslabenou imunitou.
Corynebacterium
Rod gram-pozitivních aerobních nebo fakultativně anaerobních bakterií,
nepohyblivé, nesporulující, tyčinkovitého tvaru. Většinou nejsou patogenní
pro člověka, ale jsou součástí běžné mikroflóry kůže. Vyskytují se na
různých nikách, jako je půda, odpadky, rostliny, kůže. Např.
Corynebacterium diphtheriae (původce záškrtu) je významný patogen
člověka.
Mycobacterium (mykobakterie)
rod nepohyblivých a nesporulujících bakterií
ze samostatné čeledi
Mycobacteriaceae, řazené k aktinomycetám. Jsou většinou považovány za
grampozitivní. Mají však komplexní buněčnou stěnu, předpona –myko
odkazuje na fakt, že jejich buněčná stěna obsahuje vosky. Mykobakterie
rostou obecně poměrně pomalu, jsou acidorezistentní („acid fast“), tzn.
zbarvení vyvolané činidly se nedá vymýt kyselinami.
Mykobakterie jsou široce rozšířené organismy, typicky žijící ve vodě (i
chlorované vodě) a zdrojích potravy. Někteří zástupci způsobují těžká
onemocnění (tuberkulóza – Mycobacterium tuberculosis, tuberkulóza
skotu – M. bovis a lepra – Mycobacterium leprae), jsou obligátními
patogeny a nemohou žít volně.
Nocardia (nokardie)
rod grampozitivních aerobních bakterií, tyčinkovitého
tvaru, z kmene
aktinobakterií. Často však tvoří vláknité vzdušné mycelium. Jejich buněčná
stěna je podobná stěně mykobakterií.
Řadíme k nim asi 85 druhů. Nokardie se vyskytují po celém světě především v
půdě bohaté na humus.
Některé z nokardií jsou oportunisticky patogenní
(původci nokardióz).
Nokardie, které infikují člověka, se do těla dostávají z půdy. V ohrožení
onemocnění jsou zejména pacienti se sníženou imunitou (infekce HIV,
transplantace kostní dřeně, atp.)
Bacillus
rovné grampozitivní sporulující tyčinkovité bakterie o velikosti 1x4 um, z
čeledi Bacillaceae. Bakterie rodu Bacillus se využívají hlavně v medicíně,
kde produkují antibiotika. Tvoří bělavé až hnědavé nepravidelné kolonie
buněk. Tyto bakterie jsou aerobní, nebo fakultativně aerobní. Určité druhy
slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasy získané
z Bacillus subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu
proteinasy se používají především do pracích prostředků.
Bacillus anthracis
Je známá především jako původce onemocnění anthrax, v přírodě je to však
půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie patogenem
býložravých savců, nákazy u člověka jsou zaznamenávány především v
rozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použití této bakterie v
bioterorismu.
Anthrax na obarvené
mikrofotografii v slezinové tkáni
Flavobacterium
Gram-negativní, nepohyblivá, tyčinkovitá bakterie. Flavobakterie jsou
nacházeny ve vodě a v půdě na rozličných stanovištích. Některé druhy
mohou způsobovat choroby sladkovodních ryb.
Flavobacterium
psychrophilum
Clostridium
rod bakterií volně žijících hlavně v mírně kyselých půdách. Je to anaerobní,
sporulující, mezofilní, grampozitivní tyčinka. Fixuje vzdušný dusík a energii
získává máselným kvašením. Využívá se při průmyslové produkci kyseliny
máselné, na druhou stranu produkuje toxiny (Clostridium botulinum,
Clostridium tetani - Bakterie produkuje neurotoxin tetanospasmin, což je
podstatou procesu, v důsledku kterého dochází u infikovaných lidí k
onemocnění tetanem.
Clostridium pasteurianum
žije v půdě, má schopnost vázati volný dusík
Erwinia
Rod gramnegativních, fakultativně anaerobních tyčinkovitých bakterií z čeledi
Enterobacteriaceae. Žijí saprofyticky, popřípadě jako paraziti zejména na
rostlinách. Z více než 20 druhů jsou nejznámější Erwinia amylovora, Erwinia
carotovora a Erwinia herbicola.
Erwinia carotovora
způsobující měkkou
hnilobu hlíz
bramboru
Podstatnou součástí buněčných stěn rostlinných buněk je celulosa (velmi
odolný, nerozpustný polysacharid). V rostlinném materiálu je obvykle
doprovázena dalšími obtížně odbouratelnými látkami, např. hemicelulosami,
pektiny, ligniny, tuky a pryskyřicemi.
Na rozkladu celulózy se podílí řada mikroorganismů, které ji štěpí
exoenzymem celulázou na celobiosu a potom na glukosu. Zastoupeni
aerobnich celulolytických bakterií je ukazatelem úrodnosti půdy.
V intenzivně obdělávaných půdách se vyskytují zástupci rodů Cellvibrio,
Cellfalcicula, Cytophaga, Sporocytophaga
Ve středně obdělávaných myxobakterie
Ve slabě obdělávaných
půdách a v kyselých půdách převládají
mikroskopické houby.
Celulóza může být rozkládaná také za anaerobních podmínek.
Cytophaga
Sporocytophaga
MYXOBAKTERIE
Význam v případech, kdy je třeba určit
původ fekálního znečištění.
Myxobakterie –jako významné
celulolytické druhy se vyskytují mimo jiné
v zažívacím traktu býložravců.
Jejich zvýšený výskyt ve vodě tak může
prokázat znečištění pocházející ze
zemědělských provozů.
Životní cyklus je specifický – vyznačuje
se tvorbou makroskopicky zřetelných
plodniček.
Ve vodě mohou přežívat poměrně dlouho
(až rok), jejich počty zde klesají, neboť se
zde rozmnožují jen v omezené míře.
8. ÚKOL - Mikroorganismy v půdě
A. Celulolytické bakterie v půdě
Cíl úkolu:
Zjistit, zda se ve vzorcích půdy vyskytují celulolytické bakterie
Pomůcky:
půdní vzorky proseté sítem o velikosti ok asi 2 mm, nastříhané proužky
filtračního papíru velikosti 4 x 1 cm, pinzeta, stříkačka s destilovanou vodou
Provedení:
Vzorky proseté zeminy dáme do Petriho misek, povrch zarovnáme. Mírně
provlhčíme a na rovný povrch uložíme pinzetou paralelně vedle sebe
několik proužků filtračního papíru. Kultivujeme při teplotě 26°C.
Vyhodnocení:
Hnědé, oranžové nebo zelené skvrny na povrchu papírků signalizují přítomnost
celulolytických bakterií. Jejich účinkem se papír rozpadá a mizí
Porovnáváme jednotlivé typy zemin. Humusem bohaté zeminy obsahují více
celulolytických bakterií než půdy humusem chudé a bezstrukturní. V
písčitých půdách se vyskytují málo.
B. Průkaz bakterií v půdě/zemině
Cíl úkolu:
Prokázat přítomnost mikroorganismů ve vzorcích půdy
Pomůcky:
Vzorky půdy, sterilní fyziologický roztok, zkumavky, dělené pipety
na 10 ml, mikropipety, hokejky, agarová plotna MPA.
Provedení:
1 g zeminy suspendujeme v 10 ml fyziologického roztoku a důkladně
protřepeme. Ze suspenze přeneseme:
0,1 ml na povrch agarové plotny /MPA/ a rozetřeme hokejkou
1 ml roztoku z první zkumavky přeneseme do 9 ml fyziologického
roztoku, protřepeme, přeneseme 0,1 ml na povrch agarové plotny
/MPA/ a rozetřeme hokejkou (ředení možno opakovat)
Naočkované plotny inkubujeme v bioinkubátoru při teplotě 26°C 2448 hod
9. ÚKOL - Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika
Stanovení účinnosti antibiotik – difuzní disková metoda
Cíl úkolu:
Stanovení citlivosti/rezistence bakterií k vybraným antibiotikům
terčíkovou metodou, určení účinného antibiotika
Pomůcky:
zkumavky s tekutou půdou (MP bujón) a namnoženými kmeny bakterií
(E. coli), kotoučky filtračního papíru Sensi-La-Dish (nasyceny antibiotiky
dané koncentrace), sterilní MPA, sterilní hokejka, sterilní pinzety
Provedení:
Povrch agarové plotny MPA naočkujeme suspenzí bakteriálního kmene
(100 μm) /např. S. aureus, E. coli, B. atrophaeus/ nebo roztokem vlastních
bakterií a položíme barevné kotoučky Sensi disků v pravidelných
vzdálenostech do kruhu. Petriho misku obrátíme dnem vzhůru a
inkubujeme 24 h při teplotě 37°C.
Stanovení účinnosti přírodních antibiotik – česnek
Princip:
Česnek obsahuje ALLIIN (S-allyl-L-cystein sulfoxid)
Alliin je prekurzorem fytoanticipinu s názvem ALLICIN
(diallylthiosulfinát), který vzniká po porušení pletiv působením enzymu
alliinasy
Pomůcky:
sterilní MPA, bakteriální kultury na pevném nebo v tekutém médiu,
klička nebo dávkovač, sterilní hokejka, sterilní pinzety, třecí miska,
váhy, česnek
(Allium sativum - český, čínský)
Provedení:
MPA očkujeme známými postupy /E. coli/, 0,5 g česnekového extraktu
naneseme na svrchní víčko Petriho misky (allicin se odpařuje),
přiklopíme naočkovaným agarem a dnem vzhůru inkubujeme 24 h při
teplotě 37°C.
Normální mikroflóra sliznic a
pokožky člověka
Normální bakteriální flóra kůže a sliznic
Každý jedinec je po narození postupně osídlen mikroorganismy ze zevního
prostředí
Za normální se považují jen bakterie, even. plísně, (nikoliv viry pro jejich
obligatorní intercelulární parazitismus)
Povrch těla, který zahrnuje kůži, sliznice gastrointestinálního, urogenitálního a
respiračního traktu, je trvalé kolonizován jen omezeným počtem druhů, jejich
výběr je pro danou lokalitu charakteristický. V této lokalitě se tyto druhy jako
patogeny vůči hostiteli nechovají.
Vzájemný kvantitativní vztah mezi druhy je udržován v rovnováze = normální
flóra, residentní flóra. Normální flóra ovlivňuje fyziologické funkce
(vstřebávání, peristaltiku), produkuje vitamíny.
Flóra transientní (přechodná), kdy sliznice je krátkodobě kolonizována
druhem, který nevyvolává patologické změny
Žádný z druhů patřících k normální flóře není primární patogen, ale v jiných
lokalitách se může uplatnit jako podmíněný patogen
Význam normální flóry v protekci kůže a sliznic před invazí druhů s vyšší
patogenitou je výsledkem souhry rozličných mechanismů, z nichž se
nejvíce uplatňuje obsazení buněčných receptorů, kompetice o živiny,
produkce bakteriocinů, vznik metabolických produktů inhibujících růst (kys.
mléčná), změny prostředí (pH).
U bezmikrobních jedinců se vyvíjí imunitní systém podstatně obtížněji a je
proto zranitelnější zevní infekcí. Naopak trvalá přítomnost mikrobů na
sliznicích představuje významné riziko infekce endogenní. U imunosupresí
je větší riziko infekce endogenní než ohrožení infekcí z vnějšího prostředí.
Před transplantacemi a u radikální imunosupresívní léčby obecné se toto
riziko omezuje dekontaminací, tj. vyhubením veškeré residentní flóry. Po
ukončení období hluboké imunosuprese se pak normální flóra obnovuje
rekolonizací s využitím známých kmenů těch druhů, které se podílejí na
normální flóře
Normální flóra kůže
Normální osídlení je ovlivněno vlastnostmi kůže (vlhkost, umístění mazových
a potních žláz) a kontaminací ze sousedních sliznic.
Hlavní bakteriální druhy na kůži Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus hominis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes.
S. aureus nejčastěji na perineu, ale i na sliznici nosu.
V oblastech s vyšším výskytem mazu – propionibacteria, lipofilní
korynebakterie
Hlavní houbové druhy: Candida, Torulopsis, Pityrosporum
Největší osídlení je v uzavřených oblastech (axila, meziprstní prostory na
nohou, perineum), kde při vlhké zapářce je možný snazší průnik do hloubky.
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus
Oportunní patogen,
napadá oslabené pacienty.
Dostane se do těla s
předměty z umělé hmoty,
velmi dobře adheruje na
jejich povrch.
Patogenní pro člověka a další teplokrevné
živočichy. K onemocnění dochází při
oslabení organismu. Zánětlivá ložiska v
ranách, průnik do krve a další infekce – v
plicích, osrdečníku, mozkových blanách,
kostech. Toxinózy. Mastitida. Napadení
střev.
Propionibacterium acnes
Je spjata s výskytem
akné.
Candida
Přemnožení způsobuje oslabený
imunitní systém, užívání
antikoncepčních pilulek, antibiotik,
stres, špatná výživa, nadměrné
množství cukru, alkoholu . Výtoky z
pochvy, ekzémy, povleklý jazyk,
onemocnění kůže, nehtů.
Torulopsis
Respirační trakt
Má více ekosystémů s charakteristickou flórou
Nos, orofarynx (ústní část hltanu) a tonsily
kolonizovány.
(mandle) jsou velmi hustě
V nosní dutině – Staphylococcus epidermidis, méně často Coryneformní
bakterie, v 10% Staphylococcus aureus
Farynx, tonsily – různé druhy ústních streptokoků a nepatogenní druhy
neisserií
Z druhů s vyšším patogenním potenciálem se tu přechodně mohou
vyskytovat v závislosti na roční době a prostředí – Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis a Haemophilus influenzae.
V podmínkách jednotek intensivní péče a při změnách fyziologické funkce
sliznice mohou kolonizovat horní cesty dýchací
gramnegativní tyčky,
zejména enterobakterie (klebsielly, escherichie), ale i pseudomonády.
Tyto druhy mohou přecházet na sliznice dolních cest dýchacích, které jsou za
normálních okolností sterilní.
Staphylococcus aureus kolonizuje horní cesty dýchací s výjimkou nosu
obvykle jen přechodně. Často se vyskytuje spolu s virovou infekcí.
Corynebacterium sp.
Streptococcus pneumoniae
Může způsobovat infekce plic
(pneumonie), středouší (otidis
media).
Neisseria meningitidis
Běžně se nazývá meningokok
způsobuje zánět mozkových plen
(meningitidu), probíhá velmi
rychle a bez léčby zabíjí do
několika dnů
Haemophilus influenzae
druhotné záněty dýchacích cest,
prvotní poškození sliznice
způsobí jiný patogen především
vir, často provází chřipku
Zažívací trakt
Dutina ústní – ústní streptokoky (Streptococcus albus), Streptococcus
pneumoniae, nesporulující anaeroby (koky, Actinomyces)
Povrch zubů – bakterie tvoří podstatnou část zubního plaku. Kyseliny
vznikající při bakteriálním metabolismu poškozují zubní sklovinu a vedou tak
ke vzniku zubního kazu. Nejčastěji – Streptococcus mutans.
V jícnu se obvykle normální flóra neprokazuje, což je dáno patrně velmi
rychlou pasáží obsahu do žaludku.
V žaludeční dutině – výrazné uplatnění HCl, výrazně omezuje výskyt bakterií v
žaludečním obsahu. Dále mohou přejít acidoresistentní bakterie, plísně.
Převažují druhy, které svým metabolismem neutralizují kyselé prostředí.
Střevo – osídlení střeva je odlišné podle způsobu výživy (vegetariáni), podle
geografických oblastí (tropy).
V tenkém střevě – velmi nízká koncentrace bakterií (do 105 na 1 g). Malý
obsah bakterií je způsoben rychlou peristaltikou a vlivem žluče. Ústní
streptokoky, enterokoky (Enterococcus faecalis, E. faecium), enterobakterie
(Enterobacteriaceae) a laktobacily.
Streptococcus mutans
Lactobacillus sp.
Enterococcus (Streptococcus) faecalis
Jsou podmíněně patogenní, původci
infekcí močových cest, žlučových
cest, gynekologických zánětů ,
pooperačních komplikací.
Enterobacter sp.
Mohou být původci akutních i
chronických zánětů močových
cest.
V tlustém střevě a stolici se hodnoty bakterií pohybují mezi 109-1011 bakterií
v 1 g.
Identifikováno více než 400 druhů bakterií, které je možno považovat za
normální flóru tlustého střeva. 95% jsou striktní anaerobové – Bacteroides,
Fusobacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium. – tyto svými
metabolickými produkty inhibují růst jiných bakteriálních druhů (tvorbou
kys. octové, máselné, mléčné).
Enterokoky (Enterococcus faecalis, E. faecium).
Dále Enterobacteriaceae – Escherichia coli a laktobacily
U kojenců v dobrých hygienických podmínkách je střevní sliznice
kolonizována převážně laktobacily.
Fusobacterium
Eubacterium
Bifidobacterium
Clostridium difficle
Escherichia coli
Enterotoxikogenní kmeny
mohou vyvolávat průjmy
Urogenitální trakt
Z močových cest je normálně osídlena pouze sliznice přední části močové
trubice – Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, koryneformní
tyčky, přechodně se může vyskytnout Escherichia coli a Proteus.
Z patogenních druhů Neisseria gonorhoae (kapavka), Treponema palidum
(syfilis)
Na zevním genitálu žen se normálně vyskytuje flóra obdobná jako na kůži,
převládají grampozitivní koky (Staphylococcus epidermidis, Enterococcus
faecalis, Sarcina) a také Candida.
Flora ve vagíně je ovlivněna hormonálně. Po porodu přetrvává osídlení
laktobacily, v dětství až do puberty je ve vagině flóra podobná jako na zevním
genitálu. S pubertou nastupuje osídlení laktobacily, které snižují pH a tím se
snižuje možnost osídlení jinými bakteriálními druhy.
Kromě laktobacilů – nesporulující anaerobi, grampozitivní koky a fungi
(Candida).
Někdy ve vagině – Streptococcus agalactiae – riziko pro novorozence.
Proteus
Sarcina
Streptococcus agalactiae
Může ohrozit zejména novorozence
(nakazí se v průběhu porodu), způsobuje meningitidy, sepse,
pneumonie
ZUBNÍ PLAK
= PŮVODCE ZUBNÍHO
KAZU
5. ÚKOL - Průkaz bakterií na povrchu kůže člověka vyhodnocení minulého cvičení
Vyhodnocení:
1. Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich
morfologické vlastnosti.
2. Srovnáme počet kolonií vyrostlých z otisků neumytých rukou a umytých
rukou po použití desinfekce
3. Z vybraných kolonií si připravíme nativní preparát, který prohlédneme
velkým zvětšením mikroskopu a popíšeme. Tvar kolonií, tvar buněk pod
mikroskopem.
TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ
Bakterie kultivované z otisku prstu
10. ÚKOL - Izolace mikroorganismů – křížový roztěr
Cíl: seznámit studenty se způsobem získávání čistých kultur
mikroorganismů
Pomůcky: Bakteriologická klička, Petriho misky s živnou půdou,
lihový kahan
Postup:
Ze suspenze mikrobů ve fyziologickém roztoku nebo přímo z
vyrostlé kolonie na agaru odebereme bakteriologickou kličkou
část populace a rozetřeme do několika /3-4/ vodorovných čar po
povrchu agarové plotny. Kličku vyžíháme a po vychladnutí
přiložíme na konec rozetřených čar a znovu rozetřeme do několika
čar. Tento postup opakujeme několikrát a zakončíme vlnitou
čarou. Kultivujeme v inkubátoru při příslušné teplotě.
Kultivace bakterií ve visící kapce
= suspenze mikroorganismů visící na krycím skle, která se nedotýká
podložního skla (s vybroušenou jamkou)
používá se pro kultivaci a pozorování živých bakterií – zejména k určení
pohyblivosti (taxonomie)
vytvoření malé „vlhké komůrky“ – kapka s bakteriemi je uzavřená mezi dvěma
skly - to zabraňuje kontaminaci organismy z okolí a umožňuje kultivaci
(vzorek nevyschne jako obyčejný vodní preparát)
11. ÚKOL - Barvení mikroorganismů, mikroskopické
sledování mikroorganismů
A. Zhotovení nativního preparátu
Cíl: Pozorování bakterií pod mikroskopem
Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo, agarová miska s koloniemi
bakterií, bakteriologická klička, voda, sterilní párátko, Lugolův
roztok, lihový kahan, imerzní olej a objektiv.
Provedení:
Sterilním párátkem sejmeme vzorek hlenu z krčku povrchu zubu,
resp. bakteriologickou kličkou přeneseme narostlé mikroorganismy
z Petriho misky na podložní sklíčko s malou kapkou destilované
vody nebo Lugolova roztoku. Rozmícháme a přímo párátkem
rozprostřeme do kruhové plochy/průměr asi 15 mm/
Výsledky:
Při velkém zvětšení mikroskopu pozorujeme bakterie různých tvarů
(koky, tyčinky). Zakreslíme jednotlivé mikroorganismy.
Tyčinkovitý tvar bakterií
(otisk prstu)
Kokální tvar bakterií
B. Kultivace bakterií ve visící kapce
Cíl: Pozorování živých bakterií
Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo s výbrusem, krycí sklo agarová
miska s koloniemi bakterií (Bacillus subtilis), bakteriologická klička,
kapátko destilovaná voda, vlhká komůrka, imerzní olej a objektiv.
Provedení:
Doprostřed krycího skla přeneste bakteriologickou kličkou suspenzi
bakterií. Kapátkem do každého rohu krycího sklíčka kápněte malou
kapku destilované vody a přiklopte podložním sklem s výbrusem.
Otočte, přeneste do vlhké komůrky a kultivujte několik hodin při
37°C. Po kultivaci pozorujte pod mikroskopem.
C. Negativní barvení
Cíl:
mikroskopické stanovení pouzder a slizů bakterií
Pomůcky:
odmaštěná podložní skla, černá tuš, bakteriologická klička,
sporulující kultura bakterie Bacillus atrophaeus
Provedení :
Na odmaštěné podložní sklo kápneme malé množství tuše zředěné
destilovanou vodou 1:2. V této kapce dobře rozmícháme malé
množství bakterií. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme
suspenzi po celé ploše a necháme volně na vzduchu zaschnout.
NEFIXUJEME!
Pozorujeme pod imerzí při zvětšení 1000x
Výsledek: zapíšeme a zakreslíme do protokolu
Spirillum volutans
Negativní barvení
(Burriho metoda)
Bakterie mléčného kvašení
Bakterie mléčného kvašení
Jsou schopny enzymatické přeměny sacharidů na kyselinu mléčnou (a
současně další produkty jako kys. máselná, propionová, octová, aceton,
ethanol, oxid uhličitý aj.) .
Vyskytují se jak volně v přírodě (např. odpadní vody, ovoce a ovocné
šťávy), tak jsou záměrně součástí produktů potravinářského průmyslu –
mléčné a obilné výrobky, maso a rybí výrobky, pivo, víno, nakládaná
zelenina, kysané zelí, siláž, kynuté těsto, slad a další. Jsou složkou
přirozené mikroflóry v ústech, intestinálním traktu a vagíně mnohých
živočichů včetně člověka.
Základním tvarem mléčných bakterií je tyčinka, která může být různě
deformovaná v závislosti na rodu a druhu bakterie.
Mléčné kvašení je jeden z nejvýznamnějších fermentačních procesů v
potravinářské biotechnologii.
Probíhá-li za vzniku pouze kys. mléčné, označuje se jako homofermentativní,
vznikají-li vedle kys. mléčné i vedlejší produkty, nazývá se
heterofermentativní.
Homofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice:
C6H12O6 → CH3 – CHOH – COOH
Heterofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice:
C6H12O6 → CH3 – CHOH – COOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2 + H2
Mléčné bakterie se na základě jejich enzymatického vybavení rozdělují do tří
skupin:
1) Obligátní homofermentativní bakterie
2) Obligátní heterofermentativní bakterie
3) Fakultativní homofermentativní bakterie
Čeleď Lactobacillaceae
Čeleď Lactobacillaceae řadíme do domény Bacteria, kmenu Firmicutes, třídy
Bacilli, řádu Lactobacillales.
Čeleď Lactobacillaceae zahrnuje v současnosti tři rody klasických bakterií
mléčného kvašení: Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus.
Tato čeleď byla vyčleněna na základě sekvencování genomu pro 16S rDNA
ze skupiny grampozitivních bakterií s nízkým procentuálním obsahem G +
C.
Jsou tvořeny pravidelnými, nesporulujícími, grampozitivními tyčinkami
nebo koky. Patří sem nepigmentující, mezofilní, chemoorganotrofní druhy,
které rostou pouze na kompletním médiu.
Jsou náročné na výživu – vedle sacharidů jako zdroj energie a uhlíku
vyžadují nukleotidy, aminokyseliny, vitamíny a jiné org. sloučeniny.
Některé heterotrofní laktobacily se vyskytují jako nežádoucí kontaminace ve
vinařství, pivovarnictví, drožďářství a při zpracování masných výrobků.
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
Pediococcus pentosaceus
Pediococus acidilactici
Do rodu Lactobacillus patří zejména tyto druhy:
¾
Lactobacillus acidophilus,
¾
Lactobacillus brevis,
¾
Lactobacillus casei subsp. casei,
¾
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
¾
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Lactobacillus lactis),
¾
Lactobacillus helveticus,
¾
Lactobacillus plantarum a další druhy.
Buňky mají tvar pravidelných tyčinek,
občas
také
koků.
Vyskytují
se
jednotlivě i v řetízcích, někdy tvoří
vláknité formy. Jsou grampozitivní,
nesporulující, fakultativně anaerobní,
občas mikroaerofilní
Lactobacillus acidophilus
Čeleď Streptococcaceae
Čeleď Streptococcaceae zahrnuje rody Streptococcus, Lactococcus a
Lactovum.
Patří sem patogenní, saprofytické i biotechnologicky využívané druhy. Buňky
jsou kulovité nebo oválné, vyskytují se po dvou nebo v řetízcích rozmanité
délky. Jsou grampozitivní, většinou fakultativně anaerobní, nepohyblivé a
netvoří endospory.
V mlékařském průmyslu jsou používány streptokoky: Streptococcus
salivarius subsp. thermophilus (synonymum Streptococcus thermophilus),
Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis,
Lactococcus lactis subsp. cremoris
Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus,
Lactococcus lactis
Lactococcus lactis subsp. cremoris
Čeleď Bifidobacteriaceae
Bifidobakterie náleží do třídy - Actinobacteria (Aktinomycety), podtřída
Actinobacteridae, řád Bifidobacteriales, čeleď Bifidobacteriaceae.
Od ostatních bakterií mléčného kvašení se odlišují odlišnou metabolickou
dráhou fermentace cukrů. Vedle kys. mléčné a octové produkují vitamíny jako
thiamin a laktoflavin.
Tvoří přirozenou součást střevní mikroflóry savců a prostřednictvím svých
metabolitů se podílejí na potlačení nežádoucích mikroorganismů v zažívacím
traktu, čehož se využívá při léčení zažívacích potíží. Jsou součástí
mlékárenských výrobků na bázi jogurtů.
Nejčastěji využívaní zástupci r. Bifidobacterium – B. animalis (syn. B. lactis) –
součást trávicího traktu, Bifidobacterium bifidum - nachází se zejména v
tlustém střevě a v pochvě.
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium lactis
Kysané mléčné výrobky
Kysané mléčné výrobky (též fermentované mléčné výrobky) je soubor všech
mléčných produktů připravených z mléka za přídavku kysacích kultur neboli
fermentujících bakterií. Nejčastěji se používají bakterie rodu Lactobacillus,
Bifidobacterium, či Lactococcus. Mezi kysané mléčné výrobky patří jogurty,
kysaná, acidofilní nebo jogurtová mléka, kysaná smetana.
Kysané mléčné výrobky
- jemná sraženina mléčných bílkovin
- delší trvanlivost, rychlá stravitelnost
- kysací kultury ze sterilního mléka a čistých kultur
- anaerobní přeměna laktosy na kys. mléčnou, pH 3,8 - 4,6
Rozdělení dle mikrobiálních druhů:
- mesofilní bakterie mléčného kvašení
(smetanový zákys, podmáslí . . .)
- termofilní bakterie mléčného kvašení
(jogurt, acidofilní mléko . . .)
- bakterie mléčného kvašení a kvasinky
(kefír, kumys . . .)
Bakterie mléčného kvašení se využívají také v průmyslu masném, tukovém,
konzervárenském a pekárenském.
Jako monokultury se v mlékárenské výrobě používají mikroorganizmy, které
obsahují jen jeden kmen jednoho druhu mikroorganizmů, popř. jestliže
obsahují více kmenů jednoho druhu mikroorganizmů
Jako směsné bakteriální kultury, - obsahují více druhů a kmenů bakterií
Směsné kultury bakteriální a kvasinkové - obsahují více druhů a kmenů
bakterií i kvasinek zkvašujících laktózu
Některé monokultury jsou využívány k sestavování směsných kultur. Tyto
směsné kultury se pak většinou nazývají podle výrobku, k jehož výrobě slouží
kultura jogurtová (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus
acidophilus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Bifidobacterium
bifidum)
kefírová (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp.
cremoris, Lactobacillus casei, Candida kefir)
smetanová (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)
Probiotika
Probiotika jsou bakterie a to převážně bakterie mléčného kvašení. Ne
všechny mléčné bakterie však mají probiotické vlastnosti.
Bylo navrženo přes dvacet kriterií, která by měla charakterizovat
mikroorganizmy s probiotickými vlastnostmi. Odborníci se shodli na pěti
z nich:
- jsou humánního (lidského) původu
- nejsou patogenní
- neničí se v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během
průchodu zažívacím traktem zničeny nebo oslabeny)
- neničí se během výrobního procesu a zůstávají životaschopné po celou
dobu trvanlivosti potraviny
- je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav
Příklad prokázaných účinků probiotik:
- snižují účinek některých karcinogenních látek z mikroorganizmů
- zvyšují odolnost vůči průniku infekcí (např. proti průjmovým
onemocněním)
- posilují intestinální mikroflóru při tlumení alergických reakcí
- zlepšují kvalitu života pacientů se zánětlivým onemocněním střev
11. Úkol – Barvení mikroorganismů, mikroskopické sledování
mikroorganismů
D. bakterie mléčného kvašení
Cíl úkolu:
Zaznamenat výskyt bakterií mléčného kvašení
Pomůcky:
Kysané mléčné výrobky/podmáslí, kyška…/, jogurt, zředěný karbolfuchsin,
Pasteurova pipeta, bakteriologická klička, kahan, odmaštěná podložní skla,
imerzní objektiv a olej
Provedení:
Na odmaštěné podložní sklo přeneseme kapku mléčného výrobku
/podmáslí, kyška…/, nebo vyžíhanou bakteriologickou kličkou malé
množství jogurtu a rozetřeme po povrchu sklíčka.
Preparát necháme zaschnout, opatrně fixujeme nad plamenem a barvíme 5
minut zředěným karbolfuchsinem. Barvivo slejeme, opláchneme vodou a
po osušení na vzduchu prohlížíme imerzním objektivem.
Výsledek:
Zaznamenáme v podobě obrázku do protokolu.