Návody pro laboratoře sladařství a pivovarství

Transkript

Návody
Laboratoř sladařství a pivovarství
Technologické cvičení
Část A: Rozbor surovin pro pivovarskou a sladařskou výrobu
1.
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.2.1
Rozbor ječmene
Mechanické a chemické rozbory
Stanovení obsahu vody
Stanovení hektolitrové hmotnosti ječmene
Stanovení absolutní hmotnosti ječmene
Fyziologické rozbory
Stanovení klíčivé energie a citlivosti na vodu
2.
2.1
2.1.1
2.1.2
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
2.2.8
Rozbor sladu
Smyslové zkoušky
Posouzení barvy, vůně, lesku, tvaru, velikosti a vyrovnanosti zrn
Stanovení moučnatosti a sklovitosti sladu
Fyzikálně-chemické rozbory
Obsah vody ve sladu
Příprava kongresní sladiny, stanovení relativní hustoty sladiny
a stanovení extraktu sladu
Stanovení zcukření sladiny
Posouzení vůně, čirosti a doby ztékání sladiny
Stanovení pH a barvy sladiny
Stanovení aminodusíku sladiny
Stanovení sacharidických složek sladiny metodou HPLC
Stanovení volných aminokyselin sladiny metodou HPLC
3.
3.1
3.1.1
3.2
3.2.1
3.2.2
3.3
Rozbor vody
Neutralizační kapacita
Stanovení zjevné a celkové alkality
Tvrdost vody
Stanovení celkové tvrdosti
Stanovení obsahu iontů vápníku a hořčíku
Výpočet zbytkové alkality vody
4.
4.1
4.2
4.3
Rozbor chmele
Stanovení konduktometrické hodnoty chmele a chmelového extraktu
Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin metodou HPLC
Stanovení celkových polyfenolů piva podle EBC
5
5.1
Rozbor pivovarských kvasnic
Provozní mikrobiologická kontrola
5.2
5.2.1
5.2.2
5.3
5.4
5.5
Stanovení viability kvasnic barvícími technikami
Barvení methylenovou modří metodou podle EBC
Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru
Stanovení vitality kvasnic acidifikačním testem
Charakterizace bakteriální kontaminace metodou PCR
Charakterizace bakteriální kontaminace metodou FISH
Část B: Výroba piva
1.
2.
Příprava mladiny
Mikrobiologická kontrola várečných kvasnic
2.1
2.2
3.
3.1
3.2
3.3
4.
4.1
5.
5.1
6.
6.1
Posouzení kvasnic podle makroskopických znaků
Stanovení vitality a viability kvasnic
Rozbor mladiny
Stanovení pH a barvy mladiny
Stanovení extraktu mladiny
Stanovení celkových hořkých látek podle EBC
Zakvašení a hlavní kvašení
Stanovení pH, zdánlivého extraktu a počtu buněk ve vznosu
Dokvašování piva
Stanovení pH, zdánlivého extraktu a obsahu vicinálních diketonů
Analytické hodnocení hotového piva
Stanovení zdánlivého a skutečného extraktu, obsahu alkohol
a původní koncentrace mladiny
Stanovení sacharidů metodou HPLC
Stanovení volných aminokyselin piva metodou HPLC
Senzorické hodnocení hotového piva
6.2
6.3
6.4
6.5
7.
Použité literární zdroje:
1. Basařová G. a kol.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, Praha 1992 (1. díl), 1993 (2.
a 3. díl)
2. ANALYTICA EBC, European Brewery Convention, Zoeterwoude 2005.
3. Kosař K. a kol.: Technologie výroby sladu a piva, Výzkumný ústav pivovarský a sladařský,
Praha 2005.
4. Uvedené odborné časopisy a publikace
Část A: Rozbor surovin pro pivovarskou a sladařskou výrobu
1.
Rozbor ječmene
1.1
Mechanické a chemické rozbory
1.1.1 Stanovení obsahu vody
Princip:
Rozemletý zvážený ječmen se suší za stanovených podmínek a stanoví se váhový úbytek
Přístroje a zařízení: sušárna, mlýnek EBC, váženky
Pracovní postup: Vzorek ječmene se rozemele na moučku. Do navažovačky uzavřené víčkem
se s přesností ± 0,001g naváží asi 5g rozemletého ječmene. Je třeba pracovat rychle a
rozemletý vzorek uchovávat ve vzduchotěsné prachovnici, aby nenastaly změny v obsahu
vody. Suší se tři hodiny při teplotě 105 až 107°C bez víčka v elektrické sušárně. Po této době
se navažovačka vyjme, uzavře víčkem a vloží do exsikátoru asi na 20 minut a opět se zváží a
přesností ± 0,001 g.
V případě, že obsah vody v ječmeni je vyšší než 15%, musí se 100 g ječmene (celá
zrna) předsoušet v drátěném košíčku při teplotě 50°C po dobu 3 až 4 hodin. Po předsoušení se
opět zváží a vypočte se úbytek vody. Pak se ječmen rozemele a voda se stanoví popsaným
způsobem.
Výpočet a vyhodnocení:
v
A *100
G
v – obsah vody (%),
G – navážka rozemletého ječmene (g),
A – úbytek hmotnosti, tj. rozdíl mezi navážkou a usušenou moučkou (g).
Běžné hodnoty:
Obsah vody ječmene je běžně 12 až 15%, u přímého výkupu nejvýše 17%.
kde
Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta s.r.o., Praha 1993, s. 172
1.1.2 Stanovení hektolitrové hmotnosti ječmene
Princip: přesný objem ječmene se zváží a vypočte se hmotnost 100 l ječmene
Přístroje a zařízení: objemová váha podle EBC
Pracovní postup: Odměrná nádobka se upevní do kovové podložky přístroje, který je ustaven
do vodorovné polohy. Zářez v horní části se uzavře srovnávacím nožem s válcovým běhounem
a nasadí se plnicí válec. Vrchní násypný válec se uzavře záklopkou, naplní ječmenem, nasadí
na plnicí nádobu, záklopka se otevře a zrno samovolně vypadává do plnicího válce. Po
naplnění se vysune srovnávací nůž a válcový běhoun s ječmenem spadne do měrného válce.
Pak se zvolna vsune nůž zpět do zářezu, přebytečný ječmen se z plnicího válce vysype, válec
se sejme a vyjme se srovnávací nůž. Odměrný válec se uchytí za vahadlo váhy a zváží se
s přesností na ± 0,5g.
Pro výpočet objemové hmotnosti se používají tabulky (tab. 2.3, 2.4, Pivovarskosladařská analytika, s. 157,160), kde podle zjištěné hmotnosti se najde hmotnost hektolitrová,
která se udává v kg na jedno desetinné místo. Rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří
nemá být větší než 1,0g.
Běžné hodnoty:
Objemová hmotnost u jarních ječmenů se pohybuje od 68 do 75 kg. Závisí na mnoha
faktorech (odrůdě, obsahu vody, ročníku apod.) a dosahuje někdy 65 až 78 kg.
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., Praha 1993, s. 156
1.1.3 Stanovení absolutní hmotnosti ječmene
Princip: zváží se 500 zrn a hodnota se přepočte na sušinu
Přístroje a zařízení: Petriho miska, analytické váhy, pinzeta
Pracovní postup: naváží se 40 g ± 0,1 g ječmene a vysype do počítacího aparátu. Z
napočítaných 500 zrn se odstraní půlky a cizí zrna, doplní se zrny ječmene a zváží.
H
G * 2 * (100  v)
100
H – hmotnost 1000 zrn v sušině (g),
G – hmotnost původních 500 zrn (g),
v – obsah vody ječmene (%). Výsledky se uvádějí v gramech na jedno desetinné místo.
Rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být vetší než 1,0 g.
kde
Běžné hodnoty:
(v přepočtu na sušinu ječmene)
Lehké ječmeny
37 až 40 g
Střední ječmeny
41 až 44 g
Těžké ječmeny
45 g a výše.
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., Praha 1993, s. 161
1.2
Fyziologické rozbory
1.2.1 Stanovení klíčivé energie a citlivosti na vodu
Princip: stanoví se klíčivá energie zrn se 4 a 8 ml vody při teplotě 15 a 17 °C
Přístroje a zařízení: termostat
Pracovní postup: Odpočítá se dvakrát 100 zrn. Dvě Petriho misky se vyloží dvěma vrstvami
filtračního papíru a na každou se rovnoměrně rozloží 100 zrn. Do jedné misky se pipetou
přidají 4 ml vody, do druhé 8 ml vody (v obou případech vodovodní voda). Zrna se přikryjí
víčkem a ponechají se pět dnů při teplotě 15 až 17 °C v termostatu. Pak se nevyklíčená zrna
spočítají.
Počet vyklíčených zrn udává přímo klíčivou energii. Uvádí se klíčivá energie při 4 ml a
8 ml vody.
citlivost na vodu = (klíčivá energie při 4 m.) - (klíčivá energie při 8 ml)
Hodnoty se udávají v procentech v celých číslech.
Ječmen se podle citlivosti na vodu hodnotí jako
do 10 %
velmi málo citlivý
11 až 25 % málo citlivý
26 až 45 % citlivý
nad 45 %
velmi citlivý
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 166
2.
Rozbor sladu
2.1
Smyslové zkoušky
2.1.1 Posouzení barvy, vůně, lesku, tvaru, velikosti a vyrovnanosti zrn
Princip: zahrnuje smyslové posouzení čistoty vůně a vzhledu zrna a znečištění
Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, s. 228
2.1.2 Stanovení moučnatosti a sklovitosti sladu
Princip: příčným řezem se zrna rozříznou a vizuálně se stanoví podíl moučnatých,
polosklovitých a sklovitých zrn a vyjádří se jejich procentické podíly
Přístroje a zařízení: farinatom na příčný řez zrna
Výpočet a vyhodnocení: Výsledek se udává v procentech moučnatých, sklovitých a
polosklovitých zrn v celých číslech. Světlé slady mají mít moučnatých zrn nejméně 95 %,
sklovitých zrn nejvýše 2 %, tmavé slady moučnatých zrn nejméně 93 %, sklovitých nejvýše 4
až 6 %. Někdy se uvádí tzv. „průměrná hodnota sklovitosti“, která se vypočte vynásobením
počtu jednotlivých zrn dále uvedeným koeficientem: sklovitá zrna -1, polosklovitá zrna - 0,5,
zrna se sklovitými špičkami - 0,25. Součet udává průměrnou sklovitost v procentech.
2.2
Fyzikálně-chemické rozbory
2.2.1 Obsah vody ve sladu
Princip: rozemletý zvážený slad se suší za stanovených podmínek a stanoví se váhový
úbytek
Přístroje a zařízení: sušárna, mlýnek EBC, váženky
Pracovní postup: Vzorek sladu se rozemele na moučku. Do váženky uzavřené víčkem se s
přesností ± 0,001g naváží asi 5g rozemletého ječmene. Je třeba pracovat rychle a rozemletý
vzorek uchovávat ve vzduchotěsné prachovnici, aby nenastaly změny v obsahu vody. Suší se
tři hodiny při teplotě 105 až 107°C bez víčka v elektrické sušárně. Po této době se navažovačka
vyjme, uzavře víčkem a vloží do exsikátoru asi na 20 minut a opět se zváží a přesností ± 0,001
gramu.
v
A *100
G
v – obsah vody (%),
G – navážka rozemletého sladu (g),
A – úbytek hmotnosti, tj. rozdíl mezi navážkou a usušenou moučkou (g).
Běžné hodnoty:
Obsah vody ve sladu je v rozsahu 3 až 5% podle typu vyráběného sladu
kde
2.2.2 Příprava kongresní sladiny, stanovení relativní hustoty sladiny a stanovení
extraktu sladu
Princip: Rmutováním jemně rozemletého sladu standardním rmutovacím, tzv.kongresním
postupem se získá sladina, ve které se stanoví relativní hustorta v Reischauerově pyknometru
(se stanovenou vodní hodnotou) za předepsaných podmínek. V tabulkách se k hodnotám
relativní hustoty najde hodnota extraktu sladiny - hmotnostní zlomek extraktu sladiny (%).
Přístroje a zařízení:
mlýnek Miag nebo DLFU seřízený na 90% ± 1% moučky
rmutovací lázeň (frekvence otáčení míchadel 80 až 100 min -1)
kádinky o objemu 500 ml
nálevky, průměr 150 mm
skládané filtry, průměr 320 mm (Scheicher-Schull č. 597 1/2)
pyknometr podle Reischauera nebo denzitometr
vodní lázeň na 20 °C ± 0,05 °C pro temperaci pyknometrů
sádrová destička pro stanovení zcukření.
Chemikálie a roztoky:
jodový roztok, c (½I2 ) =0,02 mol.l-1
Pracovní postup: Extrakt sladu se stanoví ve sladině připravené tzv. kongresním postupem,
což je standardním způsobem provedený infúzní rmutovací postup s jemné rozemletým sladem
(podíl moučky 90 % ± 1 %). Hodnota stanoveného extraktu informuje o obsahu extraktivních
látek ve sladu a o předpokladu jejich uvolnění v procesu rmutování. Získaná kongresní sladina
se používá pro stanovení řady dalších analytických znaků sladu: zcukření, stékání, barvy,
čirosti, viskozity, pH, rozpustných dusíkatých látek apod. Přibližně 60 g sladu se rozemele na
předepsaném mlýnku a 50 g ± 0,05 g rozemletého vzorku se naváží do rmutovací kádinky. Za
stálého míchání se vzorek přelije 150 ml destilované vody 45 °C teplé a tyčinka se opláchne 50
ml stejně teplé vody. Rmutovací kádinka se ihned vloží do rmutovací lázně na teplotu 45 °C,
zapojí se míchadla a při teplotě 45 °C se rmutuje 30 minut. Pak se teplota zvyšuje na 70 °C a to
tak, že se každou minutu zvýší teploty rmutu o 1 °C, tzn. za 25 minut se dosáhne 70 °C. Po
dosažení této teploty se přidá 100 ml destilované vody 70 °C teplé a od tohoto okamžiku za 10
minut se odebere vzorek na zkoušku zcukření. Teplota 70 °C se udržuje l hodinu. Pak se rmut
ochladí během 10 až 15 minut ve rmutovací lázni studenou vodou na teplotu asi 20 °C.
Míchadla se opláchnou destilovanou vodou, rmutovací kádinky se vně dokonale osuší a obsah
se dováží na 450 g destilovanou vodou. Po dokonalém promíchání se rmut nalije na skládaný
filtr. Prvních 100 ml filtrátu se vrací zpět na filtr. Filtrace je ukončena, když obsah filtru
(mláto) popraská, jinak se filtrace ukončí po dvou hodinách. Filtrát se promíchá a ihned se
stanoví relativní hustota. Zbylý podíl se bere na další stanovení. Relativní hustota se stanoví
pyknometricky s přesností ± 0,0005 nebo densitometricky.
Výpočet a vyhodnocení: K stanovené relativní hustotě (pyknometricky nebo denzitometrem)
se vyhledá v tab. 3.5 (Pivovarsko-sladařská analytika, s. 319) hmotnostní zlomek extraktu v g
na 100 g sladiny (%) a vypočte se obsah extraktu v původním sladu a v sušině sladu podle
následujících vztahů
Ep 
Es 
P(v  800)
100  P
100 E p
100  v
Ep – je obsah extraktu v původním sladu (%),
P – hmotnostní zlomek extraktu sladiny odečtený z tab. 3.5 (%),
v – obsah vody ve sladu (%),
Es – extrakt v sušině sladu (%). Výsledky se uvádějí v procentech na jedno
desetinné místo.
Přesnost stanovení: rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nemá být větší než
0,3%, rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být vetší než 0,6%.
Kde
Běžné hodnoty:
Světlé slady:
79,0 až 82,0% v sušině
Tmavé slady:
Nakuřované slady:
2.2.3 Stanovení zcukření sladiny
Princip: Vzorek sladiny reaguje s roztokem jodu a posuzuje se míra rozštěpení škrobu
Chemikálie a zařízení: Sádrová destička, jodový roztok, c (1/2 I2 = 0, 02 mol.l-1)
Pracovní postup:
Kontrola 10 minut po dosažení teploty 70° C, při zcukření po přídavku jodového
roztoku ke kapce vzorku kanárkově žluté zabarvení. Zcukření 10 až 15 minut – velmi dobré, 10
až 15 minut dobré, 15 až 20 minut - vyhovující, nad 20 minut – nevyhovující.
Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, s. 250
2.2.4 Posouzení vůně, čirosti a doby ztékání sladiny
Princip: Vůně kongresní sladiny udává, zda slad je připraven ze zdravého ječmene a
nezávadným technologickým postupem. Čirost sladiny ukazuje na dobré rozluštění a
dostatečné odležení sladu. Rychlé stékání je znakem dobrého rozluštění sladu a dokonalého
zcukření sladiny a je důležité především z hlediska scezování sladiny.
Pracovní postup:
Kontrola vůně v průběhu rmutování, kontrola čirosti při stékání sladiny, doba stékání
se posuzuje během filtrace. Stupnice hodnocení čirosti je: čirá, opalizující, kalná. Normální
stékání u kongresních sladin je do 1 hodiny, pomalé do 2 hodin, špatné nad 2 hodiny.
2.2.5 Stanovení pH a barvy kongresní sladiny
Princip: Měření pH sladiny je důležité pro posouzení rozluštění sladu. Hodnota pH
ovlivňuje některé analytické ukazatele - extrakt, Kolbachovo číslo, relativní extrakt při teplotě
45° C, barvu apod. Kyselejší sladiny zvyšují vyloužitelnost látek během rmutování. pH se měří
v kongresní sladině po filtraci, nejpozději do 30 minut. Výsledky se udávají na dvě desetinná
místa. Běžné hodnoty pH kongresní sladiny světlého sladu jsou 5,6 až 6,0. Barva se stanovuje
spektrofotometricky podle EBC ve zfiltrovaném vzorku při 430 nm
Chemikálie a zařízení:
pH-metr, spektrofotometr, zařízení pro membránovou filtraci, membránové filtry (0,45 µm),
křemelina
Pracovní postup:
Vzorek se zfiltruje přes membránu (při hodnotě zákalu vyšší než 1 jednotka EBC s přídavkem
0,1 % křemeliny) a změří se absorbance při 430 nm. Barva vzorku se vypočte podle vztahu
B = 25 . f . A430
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252, 257
2.2.6 Stanovení aminodusíku sladiny ninhydrinovou metodou
Princip: Metoda ninhydrinová je založena na oxidační dekarboxylaci aminokyselin při
pH 6,7 a následné reakci neredukované a redukované formy ninhydrinu
ninhydrinové činidlo, ředící roztok, standarní roztok (glycin), reagenční baňky, vodní lázeň,
spektrofotometr
Pracovní postup: Vzorek sladiny (mladiny) se 100krát ředí, po přídavku ninhydrinového
činidla (2 ml vzorku + 1 ml činidla) se ponechá 16 minut ve vroucí vodní lázni, ochladí, přidá
zřeďovací roztok (5 ml) a po 10 minutách se proti slepému pokusu změří absorbance při 570
nm. Výpočet obsahu aminodusíku zahrnuje naměřenou hodnotu absorbance zmenšenou o
hodnotu slepého pokusu, zřeďovací faktor a hodnotu absorbance standardního roztoku
aminokyseliny glycinu. Průměrný obsah volného aminodusíku je 150 až 250 mg/l sladiny.
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s.532
2.2.7 Stanovení sacharidických složek sladiny pomocí HPLC
Princip: Stanovení sacharidů metodou HPLC-RIDK. Mono- a oligosacharidy obsažené ve
sladině, mladině, případně hotovém pivu se dělí na ionexové koloně v Ag+ cyklu a detekují
refraktometricky.
kapalinový chromatograf Agilent 1100 s refraktometrickým detektorem
kolona Phenomenex Rezex RSO Oligosacharides 200x10 mm s předkolonkou
mikrofiltr s acetátcelulosovými filtry (0,45m)
třepačka
Chromatografické podmínky:
mobilní fáze:
odplyněná demineralizovaná voda
teplota kolony:
80C
průtok mob. fáze:
0,4 ml/min
Chemikálie:
glukóza, fruktóza a maltóza (vše p.a.)
Software:
Agilent Chemstation
Pracovní postup:
Pro kalibraci je třeba připravit 3 kalibrační roztoky maltózy, glukózy a fruktózy
v koncentracích 1, 2 a 5 g/litr. Vzorek se přefiltruje za pomocí mikrofiltru, v případě
prokvašené mladiny a hotového piva je třeba vzorek též předem vytřepat po dobu 15 min.
Následně se vzorek převede do vialky v autosampleru, další postup je již automatizován a řízen
softwarově. Sacharidy se na koloně dělí podle své molekulové hmotnosti a z kolony jsou
vymývány sestupně podle počtu glukózových jednotek, manosacharidy pak v pořadí
glukóza,fruktóza. Výsledky jsou vyhodnoceny pomocí kalibračních křivek, přičemž v případě
maltoriózy a vyšších sacharidů se používá kalibrační křivka maltózy. Výsledky se obvykle
vyjadřují v g/l a pohybují se v rozmezí 1-5 g/l u piv a 1-80 g/l u mladin a sladin (záleží na
původní koncentraci extraktu a použité technologii).
Literatura: Ondroušek, S., Dostálek, P.: Vliv technologie na vznik a využití sacharidů při
výrobě mladiny a piva, Kvasny Prum. 33(11), 1987, 322-5.
2.2.8 Stanovení volných aminokyselin sladiny HPLC
Přehled metod stanovení aminokyselin obsahuje metody klasické, založené na
spektrofotometrickém měření, a moderní, využívající HPLC, GC, GPC a HIC. V dnešní době
je většina analýz HPLC uskutečňována v systémech s reverzní fází (RP-HPLC), kde
stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze polární rozpouštědlo.
Princip stanovení:
Aminokyseliny jsou před vlastním stanovením formou předkolonové nebo postkolonové
derivatizace převedeny na vhodný derivát, dostatečně stabilní a neintegrující s nosičem.
Metoda AccQTag využívá AccQTag fluorescenčního činidla, převádějícího primární a
sekundární aminokyseliny na stabilní fluorescenční deriváty. Následuje detekce
fluorescenčním nebo PDA detektorem.
Waters Alliance HPLC systém, se separačním modulem 2695. Součástí systému jsou dvě
nezávisle řízené pumpy v sériovém uspořádání se zpětnými ventily k izokratickým a
gradientovým operacím, autosampler, dávkovací injekční stříkačky o objemu 25, 250 a 2 500
l, dávkovací smyčky, disketová jednotka. Režim externího řízení
je zajištěn
chromatografickým programem Empower.
Pracovní režim:
Derivatizační činidlo:
Standard:
Kolona:
Rozměr kolony:
Temperace kolony:
Detektor:
Eluenty:
Gradient:
Nástřik na kolonu:
Vnitřní standard:
Doba analýzy:
Stabilizace kolony:
Způsob vyhodnocení:
Waters AccQ•Fluor Reagenční činidlo (6-aminoquinolyl-Ahydroxysuccinimidyl karbamát)
Waters Amino Acid Hydrolysate Standard
Waters AccQ•Tag Amino Acid kolona Nova-Pak C18, 4 μm
150 x 3,9 mm
37 °C
Waters Multi 2475 fluorescenční detektor s excitací 250 mm, emisí
při 395 nm
A – borátový pufr (vodný roztok)
B – acetonitril (čistota HPLC grade)
C – Milli-Q voda (18 MΩ)
Čas
(min)
počáteční
0,5
18
19
29,5
33
36
51
Průtok
(ml.min-1)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
%A
100
99
95
91
83
0
100
0
%B
0
1
5
9
17
60
0
60
%C
0
0
0
0
0
40
0
40
5 μl vzorku (koncentrace aminokyselin 5 – 200 pmolů)
kyselina α-aminomáselná
36 min
9 min na začátku, 15 min na nový vzorek
program Empower
Spektrum stanovitelných základních aminokyselin:
kyselina asparagová, serin, kyselina glutamová, glycin, histidin, arginin, threonin, alanin,
prolin, cystein, tyrosin, valin, methionin, lysin, isoleucin, leucin, phenylalanin.
Pracovní postup zahrnuje deproteinaci vzorku (metanol, vymražení), odpaření, zpětné naředění
roztokem HCl o koncentraci 0,1 mol.l-1, přídavek vnitřního standardu, derivatizaci a převedení
vzorku do vialek autosampleru.
Vyhodnocení:
Chromatografický program Empower metodou vnitřního standardu umožňuje stanovení
aminokyselin v koncentracích pikomoly.
Literatura:
Instruction Manual Waters AccQ·Tag Chemistry Package, Waters Corporation, USA, 1994,
Čížková H., Hofta P., Kolouchová I., Dostálek P.: Kvasny Prum. 51, 2005, s. 47
3.
Rozbor vody
3.1
Neutralizační kapacita
3.1.1 Stanovení zjevné a celkové alkality
Princip: Neutralizační kapacita vody udává látkové množství silné kyseliny (cH+) (kyselinová
kapacita) nebo silné zásady (COH-) (zásadová kapacita), které po přidání ke zkoumané látce
změní její pH na udanou hodnotu. Celková alkalita je zvláštní případ kyselinové neutralizační
kapacity vody odpovídající látkovému množství silné kyseliny (H +), kterým po přidání ke
vzorku vody je dosaženo pH = 4,5. (KNK4,5, m-hodnota). Zjevná alkalita je zvláštní případ
kyselinové neutralizační kapacity vody odpovídající látkovému množství silné kyseliny (H+),
kterým po přidání ke vzorku vody je dosaženo pH = 8,3 (KNK4,5, p-hodnota). Alkalita se
stanoví titrací vzorku vody roztokem silné kyseliny. Indikace je vizuální nebo elektrometrická
pH-metr
mikrobyrety dělené po 0,05 ml
kyselina chlorovodíková, c(HCl) = 0,1 mol/l
0,05% roztok fenolftaleinu v 96% ethanolu
0,05% vodný roztok methyloranže
Pracovní postup:
Při stanoveni zjevné alkality se přidá ke 100 ml vzorku 0,1 ml fenolftaleinu a titruje se
odměrným roztokem HC1 o koncentraci c(HCl) = 0,1 mol/l do odbarvení indikátoru. Při
elektrometrické indikaci se titruje do pH = 8,3.
Při stanoveni celkové alkality se použije vzorek po stanoveni zjevné alkality. Přidají se 3 kapky
roztoku methyloranže a titruje se do cibulového zabarvení.
Při elektrometrické indikaci se zvolna dotitrovává do pH = 5,0, až se tato hodnota nemění. Od
zjištěné hodnoty se odečte spotřeba na slepý pokus s redestilovanou vodou.
Zjevná alkalita se vypočte podle vztahu:
Ve . c(HCl) .103
KNK
= —————————— = c (H+)
8,3
V
kde Ve
- je spotřeba odměrného roztoku HCl o c(HCl) = 0,1 mol/l,
c(HCl) - koncentrace odměrného roztoku HCl při titraci do pH = 8,3 mol/l),
KNK8,3
- zjevná alkalita (mmol/l).
Celková alkalita se vypočte podle vztahu:
KNK4,5 =
Ve . c(HCl) . 103
——————————— = c (H+)
V
kde Ve - je spotřeba odměrného roztoku HCl o c(HCl) =0,1 mol/l,
c(HCl) - koncentrace odměrného roztoku HCl při titraci do pH = 4,5 (mol/l),
KNK4,5 - celová alkalita
V (pro obě alkality) - objem vzorku (ml),
Výsledky se udávají v mmol/l s přesností na tři desetinná místa pro rozmezí 0,05 až 1,0
mmol/l, pro hodnoty vyšší s přesností na dvě desetinná místa. Metodu lze použít pro stanovení
alkality nad 0,05 mmol/l.
3.2
Tvrdost vody
Tvrdost vody není v literatuře definována jednotně; vychází se buď z hlediska
technologického, nebo analytického. Pojem "tvrdost vody" je vztahován v podstatě na obsah
iontů vápníku a hořčíku, i když jejich chemické a technologické vlastnosti nejsou rovnocenné.
Zastaralé jsou názvy tvrdost přechodná a stálá a způsob kvantitativního vyjadřování tvrdosti ve
stupních německých (°N), anglických či amerických. V příslušných tabulkách lze nalézt
přepočet dřívějších jednotek (mval/l, °N) používaných při analýze vody na současné jednotky
(mg/l, mmol/l).
3.2.1 Stanovení celkové tvrdosti – obsahu iontů vápníku a hořčíku
Vápenaté ionty jsou obsaženy ve všech vodách a společně s ionty hořčíku se podílejí na
změnách pH při výrobě mladiny a piva. Z hlediska snížení pH vlivem Ca2+ a Mg2+.má mít
varní voda nízkou celkovou alkalitu a současně vyšší obsah Ca 2+. Ionty vápníku ovlivňují také
aktivitu α-amylasy (EC 3.2.1.1), podporují sedimentaci kvasinek a pravděpodobně stimulují
vznik chladového zákalu. Ionty hořčíku se uplatňují v mnoha případech jako aktivátory
enzymových reakcí. Jejich přítomnost může také působit negativně na chuť piva, jestliže
koncentrace je vyšší než 65 mg/l.
Princip: V prostředí pH = 10 tvoří kyselina ethylendiamintetraoctová nebo její disodná sůl
(chelaton 3) nejprve s vápenatými a potom s horečnatými ionty cheláty. Vymizení Mg 2+ je
indikováno barevnou změnou eriochromové černi T. Spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3
je úměrná koncentraci Ca2+ a Mg2+.
kyselina chlorovodíková, c (HCl)) = 0,1 mol/l
- 96 % ethanol
- 0,5 % vodný roztok methylčerveně
odměrný roztok chelatonu 3, c (EDTA) = 0, 05 mol/l
- roztok eriochromové černi T
- tlumivý roztok pH = 10
Pracovní postup: Ke 100 ml vzorku vody se po zrušení celkové alkality ekvivalentním
množstvím zředěné HCl (c = 0,1 mol/l) přidá 5 ml tlumivého roztoku a po promíchání ještě 5
kapek roztoku indikátoru. Potom se titruje roztokem chelatonu 3 do jasně modrého zbarvení.
Celkový obsah Ca2+ a Mg2+se vypočte podle vztahu:
a.c.103
X = -------V
kde X
a
V
c
- je celkové množství iontů vápníku a hořčíku (mmol/l) (tzv. tvrdost),
- spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 (ml),
- objem vzorku odebraného k analýze (ml),
- koncentrace chelatonu 3 (mol/l).
Přesnost stanovení je při titraci 0,05 mmol/l, která je zároveň spodní hranicí pro zjištění
koncentrace Ca2++ Mg2+. Výsledek se udává v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa.
3.2.2 Stanovení obsahu iontů vápníku a hořčíku
Princip: V alkalickém prostředí (pH = 12 až 13) tvoří vápenaté ionty chelát s chelatonem 3
(disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové - EDTA). Konec titrace je indikován barevnou
změnou indikátoru. Spotřeba odměrného roztoku chelatomu 3 je úměrná koncentraci
vápenatých iontů
- hydroxid draselný, roztok přibližně o c(KOH) 5,0 mol/l
- kyselina chlorovodíková, c(HCl) =0,1 mol/l
- chelaton 3, c(EDTA) =0,05 mol/l
- indikátorová směs fluorexonu, thymoftalexonu a murexidu
Pracovní postup:
Objem odměřeného vzorku s obsahem Ca2+ od 2 do 20 mg se upraví přídavkem destilované
vody na objem asi 150 ml. U vzorků s celkovou alkalitou větší než 5 mmol/l se přidá
ekvivalentní množství kyseliny chlorovodíkové, c(HCl) = 0,1 mol/l, povaří 3 minuty a po
ochlazení se připipetují 2,0 ml roztoku KOH, c(KOH) = 5 mol/l. Po promíchání a přídavku
indikátorové směsi do zřetelně zeleného odstínu se titruje chelatonem 3 do fialově růžového
zbarvení.
a.c.103
X = ---------------V
Kde X - je koncentrace iontů vápníku (mmol/l),
a - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 (ml),
c - koncentrace odměrného roztoku chelatonu 3
(mmol/l),
V - objem vzorku (ml).
Výsledek se udává v mg Ca2+ na 1 litr vzorku s přesností na jedno desetinné místo, při
vyjádření výsledků v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa. Pro přepočet platí:
1 mmol Ca2+ odpovídá 40,08 mg Ca2+nebo 1 mg Ca2+ odpovídá 0,02495 mmol Ca2+.
Metodu lze použít pro stanovení Ca2+ v koncentracích 10 až 200 mg/l.
3.2.3 Stanovení obsahu hořčíku
Princip: Koncentrace iontů hořčíku se vypočítá z výsledku stanovení celkového množství Ca 2+
+ Mg2+, a výsledku stanovení Ca2+.
a.c.103
b.c.103
X = ---------------- - ---------------V1
V2
Kde X - je koncentrace iontů hořčíku(mmol/l),
a - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 při stanovení Ca2+ +
Mg2+ (ml),
b - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 při stanovení Ca2+
(ml)
c - koncentrace odměrného roztoku chelatonu 3 (mmol/l),
V1 - objem vzorku při stanovení Ca 2+ + Mg2+(ml)
V2 - objem vzorku při stanovení Ca 2+(ml).
Výsledek se udává v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa, při vyjádření výsledků v mg/l
s přesností na jedno desetinné místa. Pro přepočet platí:
1 mmol Mg2+ odpovídá 24,32 mg Mg2+,
1 mg Mg2+ odpovídá 0,0411 mmol Mg2+
3.3
Výpočet zbytkové alkality vody
Princip:
Sole varní vody ovlivňují významně pH rmutů a sladiny tím, jak reagují s rozpustnými solemi
ze sladu. Předpokládaný účinek solí určuje hodnota zbytkové alkality Ra, která je definována
jako rozdíl celkové alkality a vyrovnané alkality, přičemž vyrovnaná alkalita se rovná
vápníkové tvrdosti lomené 3,5 plus hořečnaté tvrdosti lomené 7.
Zbytková alkalita = Celková alkalita – Vyrovnaná alkalita
Ra = Tk – (TCa + 0,5 TMg)/ 3,5
Pro 12% světlou čistě sladovou mladinu se předpokládaná hodnota pH vypočte podle vztahu:
pH = K + f.Ra
kde K je 5,5 (pH sladiny připravené z destilované vody a f je faktor = 0, 17 pro Ra vyjádřenou
v mmol/l nebo = 0,03 pro Ra vyjádřenou ve °n
Literatura: Basařová G., Čepička J.: Sladařství a pivovarství, skriptum, SNTL Praha 1986, s.
70
4.
Rozbor chmele
4.1
Stanovení konduktometrické hodnoty chmele a chmelového extraktu
Princip: konduktometrická hodnota vyjadřuje obsah α-hořkých kyselin stanovených na
základě reakce s kationty Pb2+ Konec titrace je indikován konduktometricky.
Zařízení a chemikálie: toluen, methanol, roztok octanu olovnatého c = 4 %, konduktometr
- konduktometr s příslušenstvím
- magnetická míchačka
- toluen p.a.
- methanol p.a.
- 4 % methanolový roztok octanu olovnatého
Pracovní postup:
7,5 g chmelové drti nebo 1,5 g extraktu se vpraví do láhve s patentním uzávěrem, přidá se 50
ml toluenu a směs se třepe na třepačce 90 minut. Po vytřepání se obsah láhve přefiltruje přes
skládaný papírový filtr do podstavené kuželové baňky obsahu 250 ml. 10 ml eluátu se
odpipetuje do 150 ml kádinky a přidá se 75 ml methanolu. Do roztoku se ponoří
konduktometrická elektroda a za současného míchání na elektromagnetické míchačce se
přidává po 0,2 ml 4% met. roztok octanu olovnatého. Po každém přidání a promíchání se měří
vodivost roztoku konduktometrem. Tímto způsobem se pokračuje až do spotřeby 2 až 5 ml
titračního roztoku, v závislosti na obsahu -hořkých kyselin v analyzovaném chmelu.
Naměřené hodnoty se vynesou do souřadnicového systému na milimetrový papír a sestrojí se
křivka charakteru paraboly. Proložením přímek rameny paraboly se získá průsečík, který je
bodem ekvivalence. Bod ekvivalence se promítne na souřadnici spotřeby titračního roztoku a
získaný údaj se násobí faktorem 2,54. Toto číslo udává % -hořkých kyselin v původním
chmelu. Při konduktometrickém stanovení je nutné, aby všechny tři proužky na elektrodě byly
ponořeny do roztoku. Rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nesmí být větší než 0,3 %.
4.2
Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin chmele a chmelových výrobků pomocí
HPLC
Upravená metodika podle Analytica-EBC, Method 7.7
Princip:
Chmel, chmelové granule jsou extrahovány směsí ether/methanol a kyselinou
chlorovodíkovou.  a -kyseliny chmele rozpuštěné v etherové fázi jsou rozděleny pomocí
chromatografie na reverzní fázi se spektrofotometrickou detekcí při 314 nm.
Chemikálie:
 Diethylether, prostý peroxidů, p.a.
 Methanol, p.a.
 Methanol pro HPLC super gradient
 Kyselina fosforečná, 85%,  = 1,71
 Kyselina chlorovodíková, c(HCl) = 0,1 mol/l
 Eluční činidlo A: methanol/millipore voda/fosforečná kyselina v poměru 85 : 17 : 0,25
(v/v/v) cca 250 ml na 1 vzorek chmele (6 nástřiků) a standard (4 nástřiky)
 Eluční činidlo B: millipore voda (používá se pouze se Shutdown metodou!!!)
 Standardní chmelový extrakt se známým množstvím  a -kyselin (Labor Veritas,
Zürich, Switzerland), používá se jako externí standard, skladování při -18 ˚C v mrazáku
v pivovarské laboratoři, stabilita 1 rok
Přístroje a materiál:











Váhy AND
Třepačka (oranžová)
Ultrazvuková lázeň (hladina vody po naplnění cca 3 cm pod okraj)
Skleněná 250 ml láhev se závitem, gumovým tešněním a hliníkovým víčkem (pozn.: po
práci víčko a těsnění ponořte do teplé vody s Jarem)
Odměrné baňky 50 ml a 100 ml
Pipeta Biohit na 2x 5 ml
Pipeta na ether Brand handy step s 50 ml zásobníkem (krok 5)
Odměrný válec na těkavé kapaliny 100 ml
HPLC Waters W2690 s PDA detektorem W2996
HPLC kolona Waters Nova-Pak 250 x 4.6 mm, C18 s guard kolonkou nebo
Phenomenex Gemini 250 x 2.0 mm, C18 s guard kolonkou. Použití této HPLC-MS
kolony diskutovat s Ing. Dostálkem (je u ní potřeba dávat větší pozor na čistotu
rozpouštědel, nastřikovaná množství a tlaky).
Bomba s N2 na převrstvení
Pracovní postup:
Příprava externího standardu
Navažte 0,5 g standardního extraktu (mcs) do 50 ml kádinky (vraťte standard do
mrazáku) a přidejte 30 ml methanolu a rozpusťte pomocí ultrazvuku. Převeďte roztok extraktu
do 100 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Uzavřete baňku a vzniklý roztok
opatrně promíchejte. Z tohoto roztoku odpipetujte 10 ml do 50 ml odměrné baňky a doplňte po
rysku methanolem a promíchejte. Případný zákal odstraňte filtrací přes membránu 0,45 m
(Millipore). Roztok je připraven jako vzorek pro stanovení pomocí HPLC a metody externího
standardu. Skladujte tento roztok v lednici, převrstvěte jej dusíkem a chraňte jej před světlem
alobalem. Roztok je stabilní 24 hodin. Odpipetujte cca 1 ml do vialky s víčkem a těsním
(Waters) a vložte ji do karuselu HPLC autosampleru a pozici si zazanamenejte, budete ji
potřebovat při vyplňování tabulky pro nástřik vzorků .
Pozn.: Nastřikujte vzorek standardu nejméně 2krát před a 2krát po reálných vzorcích, stačí
opakovaný nástřik z jedné vialky.
Příprava vzorků chmele
Rozmělněte vzorek chmele či chmelových granulí v laboratorním mlýnku. Doba mletí 2
minuty. Každý vzorek chmele připravte 3krát k nástřiku (3x extra navážka a extrakce). Navažte
přesně přibližně 10 g jemně namletého chmele (ms) do 250 ml skleněné láhve se závitem.
Přidejte 20 ml methanolu a 100 ml diethyletheru. Zavřete opatrně láhev víčkem s gumovým
těsněním a intenzivně třepejte 30 minut na třepačce umístěné v digestoři. Poté opatrně otevřete
láhev (pracujte v digestoři), přidejte 40 ml 0,1 mol/l HCl. Opatrně uzavřete láhev a třepejte
nejméně 10 minut při optimálně intenzitě (tak aby extrakční činidlo nesmáčelo gumové
těsnění). Nechte láhev stát 10 minut aby se oddělili obě fáze. Opatrně odpipetujte 5,0 ml
etherové fáze pipetou Brand handy step do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku
methanolem. Opatrně promíchejte. Odpipetujte cca 1 ml do vialkek s víčky a těsněním
(Waters) a vložte je do karuselu HPLC autosampleru, pozici si zaznamenejte. Případný zákal
zfiltrujte pomocí 0,45 m či 0,22 m mikrofiltru a stříkačky.
Chromatografické stanovení
 V okně nastavte vlevo metodu „EBC_7_7“ a vpravo chromatografický systém „Aliance
PDA“ pokud budete analyzovat. Pozn.: Pokud jen vyhodnocujete výledky tak nastavte
„No system“. Překontrolujte správnost nastavení metody. Klikněte na záložku „View
Method“ a nahoře v lište „File“, pak „Open“ … method set EBC77_1. Pak přepněte
v záložce „View Method“ na „Instrument“ a klikněte na tlačítko „W2690/5“ a
zkontrolujte průtok mobilní fáze v záložce „Flow“ (Isocratic, Total Flow 0.550, %A
100.0, Low Limit 50.0 a High Limit 3500.0). Zároveň překontrolujte, že eluční roztok
je v láhvi A, a že je v něm zcela ponořena hadička s fritou, popsaná jako „Solvent A“!!!
Poté klikněte na tlačítko „W2996“ a překontrolujte nastavení PDA detektoru (2D Data
Collection, Method channel lambda 314.0, Method channel bandwith 1.2, Sampling
Rate 1.0 a zaškrtnout „Digital Filter“)
 Před vlastní analýzou je potřeba „zavodnit“cestu A pomocí stříkačky a programu.
Eluční činidlo přefiltrujte přes 0,45 m acetát-celulosovou membránu Sartorius a
nalijte do čistě vymyté 1 l láhve, popište složením mobilky, jménem a datem. Láhev
dobře utěsněte parafínovou folií. Po najetí základní obrazovky na Allianci stiskněte
„Menu/Status“ poté „Direct Functions“ a dále na „Dry Prime“, otevřete cestu A
tlačítkem „Open A“ , povolte zavodňovací šroub (otevřít spodní dvířka a povolit
doleva šroub mezi pumpami) a ručně zavodněte cestu stříkačkou (stačí cca 10 ml), poté
utáhněte šroub a stiskněte tlačítko „Continue“. Vyčkejte na promytí cest. Následně
stiskněte „Direct Functions“, zkontrolujte máte-li v láhvi za přístrojem (vedou k ní dvě
hadičky „zelená“ a „Seal wash in“) dostatek oplachové kapaliny (30-50% methanol) a
poté stiskněte tlačítko „Wet Prime“. Vyčkejte na promytí součástí přístroje.
 „Equilibrujte“ kolonu elučním činidlem A nejméně 30 min před nastříknutím vzorků.
Přepněte se do záložky „Run Samples“, pokud není oranžové tlačítko „View
Acquisition“, tak na něj klikněte.
Stiskněte tlačítko „Press to equilibrate
system/monitor baseline“, a zadejte Instrument Method „ebc77“ a stiskněte tlačítko
„Equilibrate/Monitor“. Přepnutím tlačítka „Control Panel“ v záložce „Run Samples“
můžete sledovat základní linii = baseline. Pokud je rovná baseline, tak můžete
nastřikovat, viz postup níže. Každý vzorek nejméně 2krát. Tj. z jednoho vzorku chmele
nejméně 6 nástřiků + 4 nástřiky na kalibraci.

Přepněte se do záložky „Run Samples“ poté máte 2 možnosti:
1.
Vypište v záložce „Samples“ tyto parametry „Vial“=číslo vialky, „SampleName“
= popis vzorku, „Inj Vol“ = nastřikovaný objem (Waters Nova-Pak 10 l,
Phenomenex Gemini 2,5 l), „# of Injs“ = počet nástřiků, „Function“ = vyberte
funkci (nejčastěji se používá Inject Samples, Inject Standard, clear calibration a
equlibrate), „Method Set/Report Method“ = vyberte EBC77_1, „Run
Time(Minutes)“ = doba analýzy (40 pro kolonu Phenomenex), ostatní parametry
nepřenastavujte. Doporučuji mít v prvním řádku jen „Function“ vybrat Clear
Calibration a „Method Set/Report Method“ vybrat EBC77_1.
2.
Použít některé z předchozích stanovení a přepsat je podle aktuálních pozic v
karuselu. Klikněte na „File“ v horní liště, poté „New Sample Set“ a poté „Using
Sample Set Method“, vybrat např. ebc77_4 a stisknout tlačítko „Open“.Poté
přepište podle aktuálního stavu.
Po nastavení tabulky stiskněte tlačítko „Press to run the current sample set method“
(zkumavky s zelenou šipkou) v panelu „View Acquisition“. V následujícím okně
vyplňte „Name for this sample set“ = napište název celého setu vzorků, „Run Mode“ =
vyplňte Run and Process, „Shutdown Method“ = vyplňte shutdown_ebc, ostatní
nevyplňujte a poté stiskněte tlačítko „Run“. Naměřená data jsou v záložce „Browse
Project“ a poté v záložce „Results“. Kliknutím na příslušný nástřik se zobrazí jeho
chromatogram a po kliknutí na „View Acquisition“ i tabulka s výsledky.
Pozn.: Shutdown metoda používá cestu B, tzn. je nutné tuto cestu promýt a připravit
stejně jako v případě cesty A. Používejte jen nově připravenou čistou millipore vodu.
Průtok mobilní fáze 0,05 ml/min, Low Limit (psi) je tentokrát 0.
 Vyhřívání kolony není u této metody nutné, pracuje se při laboratorní teplotě. Pro
zvýšení přesnosti vyhřejte kolonu na 20 C. Po zapnutí vyberte funkci „MAN.“,
vyťukejte 20 a stiskněte „ENTER“. Po práci vyhřívání vypněte (kolíbka vzadu).
 Výsledky lze získat buď přímo pomocí software Empower nebo jednoduchým
výpočtem z vytištěných chromatogramů.
Výpočty:
Ci 
DF  ms  Cic  Ai
ms  Aic
Ci = koncentrace složky i (např. kohumulonu) ve vzorku vyjádřená jako % hm.
DF = ředící faktor, 1 pro extrakty, 2 pro chmel a granule
mcs = navážka kalibračního extraktu v g
Cic = koncentrace složky i v kalibračním standardu vyjádřená jako % hm.
Ai = plocha píku složky i v analyzovaném vzorku (průměr ze tří ploch)
ms = navážka vzorku
Aic = plocha píku složky i v analyzovaném standardu (průměr ze 4 ploch)
Obsah -kyselin je součtem % hm. kohumulonu a a dvojpíku humulonu a adhumulonu.
Obsah -kyselin je součtem % hm. kolupulonu a dvojpíku lupulonu a adlupulonu.
C = Ccoh + Cn+adh
C = Ccol + Cn+adl
Výsledky se vyjadřují jako % hm. na jedno desetinné místo.
Literatura: Analytica-EBC, Method 7.7, European Brewery Convention, Zoeterwode 2005.
4.3
Stanovení celkových polyfenolů piva podle EBC
Princip metody:
Polyfenoly reagují se železitými ionty v alkalickém roztoku za vzniku červeného barevného
komplexu, jehož intenzita se měří spektrofotometricky při vlnové délce 600 nm.
-
spektrofotometr UNICAM 5625
laboratorní třepačka
-
-
roztok karboxymethylcelulosy (CMC/EDTA): 10 g karboxymethylcelulosy a 2 g
EDTA (ethylendiamintetraacetátdisodný – Chelaton III) se rozpustí v destilované
vodě v 1000 ml odměrné baňce
3,5 % vodní roztok citrátu železitoamonného: 3,5 g citrátu železitoamonného se
rozpustí v 100 ml odměrné baňce (roztok je stálý asi týden)
roztok amoniaku: 1 díl koncentrovaného amoniaku a 2 díly destilované vody
Pracovní postup:
Do odměrné baňky o objemu 25 ml se k 10 ml chmelového výluhu přidá 8 ml roztoku
CMC/EDTA a 0,5 ml roztoku citrátu železitoamonného. Po důkladném promíchání se přidá 0,5
ml amoniaku, promíchá se a doplní destilovanou vodou ke značce. Za deset minut se změří
absorbance v 1 cm kyvetách při vlnové délce 600 nm proti slepému pokusu. Ke slepému
pokusu se odpipetuje 10 ml chmelového výluhu, 8 ml roztoku CMC/EDTA, 0,5 ml zředěného
roztoku amoniaku a po důkladném promíchání se doplní destilovanou vodou ke značce.
Obsah celkových polyfenolů (CP) v měřeném roztoku se vypočte z rovnice:
CP = A600 x 820 (mg/l),
kde A600 je rozdíl absorbancí vzorku a slepého pokusu při 600 nm.
5
Rozbor pivovarských kvasnic
5.1
Provozní mikrobiologická kontrola
Termín kvasnice se používá pro větší množství biomasy pivovarských kvasinek, pokud se
popisují jednotlivé buňky nebo jejich vlastností používá se termín kvasinky.
Prvními ukazateli kvality kvasnic bývá posouzení makroskopických, mikroskopických znaků a
celkové vyhodnocení znečištění kvasnic(„várečných“ - použitých na zakvašení). Jako hlavní
kvalitativní vlastnosti kvasnic se pak hodnotí jejich viabilita a vitalita. Termín viabilita nebo
počet viabilních buněk (viability count) označuje počet buněk v populaci, které jsou schopné
růstu a dalšího rozmnožování. Stanovuje se několika metodami s odlišným principem.
Nejpřesnější (ale i časově nejnáročnější) jsou metody založené na buněčné replikaci,
nejrozšířenější jsou metody založené na barvení a méně používané jsou metody jejichž
principem je měření obsahu některých buněčných složek, adenosin trifosfátu (ATP), či
redukované formy nikotinamid dinukleitidu (NADH).
Termín vitalita poukazuje na fyziologický stav populace nebo na její metabolickou aktivitu.
Vitalita se v laboratorních podmínkách nejčastěji sleduje testy založenými na metabolické
aktivitě kvasinek (acidifikační test, intraceluární pH, rychlost spotřeby kyslíku atd.) nebo
metodami založenými na měření některých buněčných složek jako jsou zásobní látky
(glykogen, trehalosa atd.) nebo ATP či NADH.
5.2 Stanovení viability kvasnic barvícími technikami. Barvení methylenovou modří
metodou podle EBC
Princip: Živé buňky kvasinek redukují alkalický roztok methylenové modři na bezbarvou
formu, mrtvé buňky kvasinek se barví modře. Přesnost stanovení závisí na pH, jehož optimum
pro reprodukovatelné stanovení je 9,5-10,5.
Materiál: Bürkerova počítací komůrka, methylenová modř, mikroskop
Pracovní postup: V kapce roztoku methylenové modře se rozmíchají kvasnice očkovací jehlou
nebo tenkou skleněnou tyčinkou tak, aby vznikl preparát s počitatelným množstvím buněk v
políčku Bürkerovy komůrky nebo v zorném poli. Po přikrytí krycím sklem se ihned spočítají
tmavě modře zbarvené buňky a ostatní kvasinky. Methylenová modř buňky usmrcuje a počet
mrtvých buněk s časem roste. Prohlédne se nejméně 20 políček a výsledek se vyjádří v
procentech mrtvých buněk z celkového počtu kvasinek. Metoda je spolehlivá, dodrží-li se
předepsané podmínky a pracuje-li se rychle. Kvasinky musí být v suspenzi dobře rozptýlené,
preparát musí mít předepsanou hustotu (100-200 buněk v zorném poli), jinak se získají chybné
výsledky. Násadní kvasnice mají obsahovat méně než 5 % mrtvých buněk
Literatura: Šavel J.: Mikrobiologická kontrola v pivovarech, SNTL Praha 1980, s. 88
Smart K., A., Chambers K., M.: J. Am. Soc. Brew. Chem. 57 (1), 1999, s. 18
5.2.2 Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru
Princip: Při průtokové cytometrii jsou jednotlivé buňky unášeny laminárním proudem
kapaliny do měrné cely kde je ozáří světelný zdroj, kterým je obvykle laserový paprsek přesně
definovaných parametrů. Světelný zdroj je zaostřen na proud kapaliny, nesoucí analyzovaný
vzorek. Světelný paprsek se při průchodu jednotlivými buňkami buť pohltí, rozptýlý nebo u
obarveného vzorku emituje fluorescenční záření měří se tedy veličiny: úhel rozptylu, snímaný
v přímém směru od světelného zdroje (forward angle – FSC), odpovídající velikosti buněk,
úhel rozptylu, snímaný pod úhlem 90° od světelného zdroje (side angle – SSC), popisující
granularitu buňky, a fluorescence pro různé vlnové délky (fluorescence je také snímána pod
úhlem 90° od světelného zdroje). Z těchto měřených veličin získáme informace o počtu
procházejících jedinců, jejich tvaru, velikosti, morfologii a vitalitě. Vzniklé signály jsou
jednotlivě zesíleny fotonásobiči, detekovány a registrovány pomocí pulzního analyzátoru
napětí. Buňky mohou být analyzovány při velmi vysokých rychlostech průchodu měrnou
celou, dosahujících až několik tisíc buněk za sekundu, avšak za optimální je považováno
rychlost v řádu stovek.
Výsledkem analýzy je histogram, který ukazuje rozložení jednotlivých měřených
parametrů v rámci buněčné populace. Jestliže se současně měří v jediné buňce více než jeden
parametr, lze výsledky vyjádřit též dvou nebo třídimenzionálně histogramem nebo bodovým
diagramem pro dvě charakteristiky. Každý bod diagramu odpovídá jedné měřené částici. Mezi
nejčastěji používaný bodový diagram v průtokové cytometrií patří tzv. dot plot diagram, který
udává závislost dvou korelujících parametrů (vlastností buněk), např. popisuje závislost
velikosti buněk (FSC) na jejich granularitě (SSC). Propidium jodidem se barví pouze živé
buňky, mrtvé ne. Poznámka: propidium jodid je chemikálie se silným karcinogenním
účinkem, proto je při manipulaci nezbytné používat chirurgické rukavice či jinou vhodnou
ochranu.
Zásobní roztok barviva (10 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), pracovní roztok
barviva (1 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), fyziologický fosfátový ústojný
roztok PBS, průtokový cytometr (Partec PAS III, výrobce: Partec, GmbH Germany), argoniontový laser, červený filtr FL3 nad 600nm.
Pracovní postup:
Z hodnocených kvasnic se do odeberou dva vzorky. V jednom se kvasinky po odstředění
usmrtí dvouhodinovou fixací v roztoku 70 % ethanolu a poté znovu odstředí a promyjí
fosfátovým pufrem. Ze vzorku se přidá několik kapek do měrné kyvety a ta se doplní do dvou
třetin fosfátovým pufrem. Do kyvety se nakonec přidá 5 μl barviva a roztok se řádně protřepe.
Po vlastní analýze na průtokovém cytometru popsaném výše se vyhodnotí intenzita
fluorescence mrtvých buněk. Ta samá procedura, s pochopitelným vynecháním fixačního
kroku, je provedena i s druhou částí vzorku. Buňky, které fluoreskují ve stejném rozmezí
intenzit jako u fixovaného vzorku jsou poté vyhodnoceny jako mrtvé.
Literatura: Hutter K., J., Schaefte J.: Monatsssch. Brauwiss. 50, 1997, s. 444
Howard M.Shapiro: Practical flow citometry. Wiley-Liss publication, 3rd ed., New York, 1995
5.3
Stanovení vitality kvasnic acidifikačním testem
Princip: Acidifikační test je ukazatelem fyziologického stavu kvasnic. Test je založen na
schopnosti kvasnic snižovat pH definovaného roztoku, tato schopnost přímo koreluje
s fyziologickým stavem populace.
Chemikálie: destilovaná voda, 0,05 M roztok hydroxidu draselného a roztok s koncentrací
glukosy 20,2 g/l destilované vody.
Pracovní postup: Z třikrát odstředěných a promytých kvasnic (3000 ot./min po dobu 10 min)
se naváží 9 g do suché 150 ml kádinky. Kvasničná pasta je pak resuspendována ve 100 ml
destilované vody vytemperované na 25 OC a s pH upraveným na 6,3 (pH bylo upraveno
roztokem hydroxidu draselného). Ihned potom následuje měření pH v minutových intervalech
za stálého míchání suspense magnetickým míchadlem. Po uplynutí 10 min, se do
proměřovaného roztoku přidá ještě 5 ml glukózového roztoku. Tento roztok je vytemperován
na 25 0C. Po dalších 10 min se odečte poslední hodnota pH a tím je měření ukončeno. Výpočty
jsou provedeny podle následujících vztahů:
Apcelk .= 6,3 - pH20
AP10 = 6,3 - pH10
AP20 = pH10 - pH20
pH20 je hodnota pH po 20 min měření
Kde:
pH10 je hodnota pH po 10 min měření
AP20 je glukózou indukovaná acidifikační schopnost
AP10 je spontánní acidifikační schopnost
Apcelk je celková acidifikační schopnost
Literatura: Kara B., Simpson W. J., Hammod J. R. M.: J. Ind. Brew., 94, 1988, s 153
5.4
Charakterizace bakteriální kontaminace metodou PCR
Bakteriální kontaminace piva nepředstavuje v dnešní době pro pivovarství vážné
nebezpečí. V pivu je nejčastější kontaminace mléčnými bakteriemi. Protože mléčné bakterie
zahrnují mnoho druhů, je dosti často problém s jejich přesnou charakterizací. Na 31.
Pivovarsko-sladařském semináři v Plzni bylo referováno o nejčastějších izolátech mléčných
bakterií v pivu, a tyto izoláty byly na základě biochemických charakteristik zařazeny jako
Lactobacillus plantarum. Rod Lactobacillus je charakterizován jako G+ nesporotvorné tyčinky.
Dělí se na homofermentativní podrod Lactobacillus a heterofermentativní podrod
Saccharobacillus. Lactobacillus plantarum patří do podrodu Lactobacillus a tvoří opticky
inaktivní kyselinu mléčnou. Je velmi rozšířen v přírodě, účastní se mléčného kvašení
rostlinného materiálu (zelí, okurky apod.). Některé potravinářské podniky, jako jsou mlékárny,
využívají tuto bakterii jako kulturní mikroorganismus. Její přítomnost v pivu je ovšem
kontaminací.
Abychom potvrdili, že se jedná skutečně o Lactobacillus plantarum, použili jsme přesnější a
specifičtější metodu charakterizace izolátů bakterií, které byly izolovány ve Výzkumném
ústavu pivovarském a sladařském v Praze.
Pracovní postup:
Pracovní postup se skládá z několika kroků. Nejdříve se izoluje samotná gDNA z bakterií
pomocí kitu a je změřena absorbance pomocí spektrofotometru při vlnové délce λ = 260 nm.
Ze zjištěných hodnot je vypočtena koncentrace vyizolované DNA. K určení druhu bakterie je
použit speciální kit BrewSave (TAKARA BIO). Pomocí tohoto kitu bylo možné amplifikovat
část gDNA a podle velikosti amplifikované části určit druh.
Použité půdy a způsoby kultivace bakterií rodu Lactobacillus

Sterilní nízkotučné mléko pro uchování izolátů laktobacilů v zamraženém stavu
při teplotě -20 °C.

MRS agar (OXOID) s přídavkem aktidionu (0,025 g/l) a β-fenylethanolu (0,3%)
k uchování G+ a katalázu netvořících laktobacilů

MRS bujón (OXOID) k pomnožení izolátů laktobacilů.

MRS agar (OXOID) k namnožení izolátů laktobacilů před izolací DNA.
Izoláty bakterií na MRS médiích je třeba od doby jejich získání do možnosti jejich identifikace
velmi často přeočkovávat (1 x za 14 dní). Kultivace probíhá postupně na všech použitých
půdách v termostatu při teplotách 28 – 30 °C .
Souprava (NucleoSpin Tissue kit – TAKARA BIO) určená pro izolaci DNA
Kit tvoří sada roztoků a elučních činidel (lyzační pufr T1, promývací pufr BW, promývací pufr
B 5, eluční pufr BE), dále mikrozkumavky Eppendorf a kolony s filtrem. Jde o speciálně
upravená skleněná vlákna, která tvoří filtr na dně malé zkumavky. Tato zkumavka je svou
velikostí určena pro použití v 1,5 a 2,0 ml kyvetách. K aplikaci vzorku, promytí membrány a
eluci nukleové kyseliny slouží odstředivá síla.
Metoda umožňuje rutinní izolaci a purifikaci nukleových kyselin. Získaný produkt vykazuje
absorbanci při 260/280 nm > 1,8. Izolovaná DNA se může použít pro běžné molekulárněbiologické metody, např. PCR, transformace, stanovení sekvence a podobně. Kapacita
membrány je limitována na cca 40 g.
Vlastní izolace DNA


Odstředit 1 ml dobře narostlé kultury při 7500 min -1. Odstranit supernatant.
Peletku resuspendovat v 170 μl pufru T1. Promíchat pomocí nasávání a
vypouštění pipety (up and down).



Přidat 25 μl proteinasy K a intenzivně protřepat na statické vibrační třepačce.
Inkubovat při 56 °C po dobu minimálně 1 – 3 h nebo přes noc. Občas protřepat.
Protřepat na statické vibrační třepačce. Přidat 200 μl pufru B3, intenzivně směs
promíchat, inkubovat 10 min při 70 °C.
Přidat 210 μl ethanolu a okamžitě protřepat na statické vibrační třepačce.







Vložit NucleoSpin Tissue kolonu do sběrné 2 ml zkumavky. Vzorek odstředit 1 min.
při 10 000 min-1. Proteklý objem vylít a kolonu vložit do stejné sběrné zkumavky.
Přidat 500 μl pufru BW a odstředit při 10 000 min -1. Proteklý objem odstranit.
Přidat 600 μl pufru B5 a odstředit při 10 000 min-1. Proteklý objem odstranit.
Naprázdno odstředit po dobu 3 minut. Tímto krokem se odstraní všechna rezidua
ethanolu.
Kolonu umístit do 1,5 ml eppendorfky, do kolony přidat 200 μl pufru BE předehřátého
na 70 °C, inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě.
Kolonu odstranit, zkumavku uzavřít a pečlivě popsat. Změřit koncentraci na
spektrofotometru.
Měření koncentrace izolované DNA
Spektrofotometr Beckman DU–600, jednokyvetový, jednopaprskový spektrofotometr,
využívající jak UV tak VIS paprsků, je speciálně upravený spektrofotometr pro měření
absorbance DNA a RNA v minimálním objemovém množství. Jeho kyveta je vyrobena tak, že
na určení absorbance postačí objem měřené kapaliny již 50 μl. Určení koncentrace je velmi
důležité, protože z koncentrace určíme množství DNA, které bude dále používáno na PCR.
Gelová elektroforéza




Agaróza Serva pro DNA elektroforézu
AGAGE standard electrophoresis (Biometra)
Standard Power Pack P25 (Biometra)
TBE pufr 10 x :
Tris HCl
Kyselina boritá
EDTA


Ethidium bromid (EtBr) o koncentraci 1μg/ml
Srovnávací standard Lambda Hind III
1 Kb DNA Ladder
Velikost a kvalita amplifikované DNA se hodnotí pomocí agarosové elektroforérzy.
Elektroforézy se využívá pro rychlost a rozlišovací schopnost. Zjišťuje se čistota preparátu,
popřípadě množství a velikost DNA. Separace probíhá na základě elektrického náboje a také
na základě molární hmotnosti udávané v bp („base pairs“). Jako detekční barvivo se nejčastěji
používá ethidium bromid, který je detekován pomocí UV prosvícení. Lze ovšem použít i další
barviva, jako jsou bromfenolová modř, akridinová oranž, xylen cyanol nebo bromkresolová
zeleň.
BrewSave kit (amplifikace DNA)
http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/Catalog_d.asp?C_ID=C0224
BrewSave kit je navržený pro detekce G+ bakterií v kvašených nápojích jako jsou saké nebo
pivo. Tyto grampozitivní bakterie z řady laktobacilů jsou tolerantní k alkoholu od 12 až do 16
%, kontaminují a kazí kvašené nápoje. Vyskytují se i ve zvětralém pivu. Kit je založen na
metodě polymerázové řetězové reakci (PCR) a obsahuje specifické primery, Tag polymerázu,
směs nukleotidů a PCR pufr. Primery (oligonukleotidy) dodané v tomto kitu jsou v zastoupení:
jeden univerzální sensový a čtyři anti-sensové primery, které mohou generovat DNA fragmenty
ze širokého spektra bakterií současně v jedné zkumavce. Z velikosti amplifikovaných
fragmentů lze zjistit, o jaký druh rodu Lactobacillus se jedná. Velikosti fragmentů uvádí tab. 1.
Reverzní primer
Lactobacillus heterohichii S-14
Lactobacillus heterohichii H-1
Lactobacillus heterohichii H-42
Lactobacillus japonicum H-7
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
Lactobacillus casei subsp. casei
Lactobacillus sp.
Lactobacillus brevis
Lactobacillus heterohichii H-1A
Lactobacillus heterohichii S-37B
Lactobacillus heterohichii S-9A
S-7A
H-34B
H-7
A-1
LAM – 3R
Velikost aplifikovaných fragmentů
( párů bází – bp)
200
LA 1198
LAM – 3R
167
20
LA 1198
LAF – 3R
167
163
LAC – 3R
175
LAC – 3R
175
LA 1198
170
LAM – 3R
200
LAF – 3R
175
LAC – 3R
180
Tab.1 - Velikosti amplifikovaných fragmentů
PCR – metoda polymerázové řetězové reakce
Principem PCR je mnohonásobné kopírování úseků DNA neboli amplifikace. Úsek genomové
DNA, který chceme amplifikovat je označen specifickými oligonukleotidy zvané primery.
Jedná se většinou o oligomery s 16 až 30 jednotkami. Ty svým přesně daným pořadím
nukleotidů dosedají na gDNA a od tohoto místa začíná amplifikace. Z hlediska postupu
amplifikace jsou dva typy primerů - sensový, probíhající od 5´konce, a antisensový, který
amplifikuje opačně tj.3´konce. V kitu, použitém k amplifikaci DNA z bakterie rodu
Lactobacillus jsou použity následující primery: sensový LAU 1 a čtyři antisensové LAC – 3R,
LAF – 3R, LA1198, LAM – 3R. Vlastní amplifikace probíhá ve třech základních krocích
v několika cyklech, přičemž v každém cyklu se počet kopií zdvojnásobí. Jednotlivé kroky jsou:
 Tepelná denaturace – slouží k rozvinutí dvoušroubovice DNA. Probíhá při teplotě 94 °C po
dobu 30 sekund.
 Připojení primerů (annealing) – neboli navázání specifických primerů na odpovídající
místo rozvinuté DNA, přičemž je dodržena zásada o párování bazí. Trvá 1 min při 55 °C.
 Syntetická fáze (extenze) – za přítomnosti DNA–polymerasy se kopíruje úsek vymezený
navázanými primery. Extenze je prováděna při 72 °C po dobu 1 minuty.
Tento cyklus je opakován a počet cyklů určuje výslednou koncentraci amplifikovaného úseku
DNA. V běžné praxi se používá okolo 35 cyklů. Po skončení cyklů se většinou provedou ještě
další dva kroky: annealing po dobu 5 minut, který umožní dokončit syntézu všech vláken
DNA, a posledním krokem bývá chlazení na 4 °C.
Podmínky pro PCR cycler – Progene (Techne)

Denaturace 94 °C po dobu 30 sekund,

Annealing 55 °C po dobu 1 minuty,

Extenze 72 °C,

35 cyklů

5 minut 72 °C a poté ochlazení na 4 °C.
Po úspěšném vyizolování DNA byl použit BrewSave Kit pro amplifikaci úseku DNA, podle
jehož velikosti bychom měli určit přesný druh Lactobacillus. Z katalogu TAKARA kitů bylo
zjištěno množství látek přidávané do reakce. Postup je zřejmý z tab. 2.
TaKaRa Taq (5 jednotek/l)
10x PCR pufr
dNTP směs (2,5 mM každé)
Templát DNA
Primer 1
Primer 2
voda
celkem
0,5 l
10 l
8 l
1 g
0,2 - 1,0 M
0,2 - 1,0 M
doplnit do 100 l
100 l
Tab.2 - Směs pro PCR
Literatura:
Vohánka, J., Dostálek, P., Fiala, J., Hollerová I.: Charakterizace bakteriální kontaminace v
pivu metodou PCR, Kvasny Prum. 49, 2003, 340-342.
5.5
Technika fluorescenční in situ hybridizace byla poprvé popsána roku 1969 Parduovou a
Gallem. Použili radioaktivně značené sondy pro DNA. Neradioaktivní značení sond poprvé
publikované roku 1980 Baumannem a 1981 Langerem některé z potíží spojených s
autoradiografií odstranilo. V dnešní době se díky neradioaktivnímu značení rozšířilo používání
metod in situ hybridizace z výzkumných laboratoří do praxe.
Principem metody FISH je založen na schopnosti vazby jednořetězcové DNA sondy s
komplementárními úseky cílové DNA fixované na mikroskopickém preparátu. Hybridizace
probíhá v rozmezí 2-24 hodin, záleží na podmínkách a typu použité sondy. Při hybridizaci
dojde k navázání komplementárních úseků a zpětné renaturaci.
Někdy je pro získání optimálního výsledku vhodné preparát ještě před denaturací ošetřit,
abychom omezili nespecifickou flourescenci. Pro tento účel byla vypracována řada postupů,
jež souhrnně označujeme jako „pretreatment“
Posledním krokem FISH je detekce navázané sondy. V případě, že fluorescenční signál je příliš
slabý, je možné provést jeho amplifikaci. K tomu se používá tzv. sendvičová metoda, kdy
střídavě nanášíme další vrstvy protilátek s fluorochromy. Konečné vyhodnocení preparátu
provádíme pomocí fluorescenčního mikroskopu vybaveném sadou vhodných optických filtrů.
Vhodné sondy pro FISH dělíme do několika skupin. Jsou to jednak sondy pro specifické
chromozómové struktury, kam řadíme např. sondy centromerické a telomerické, dále sondy
celochromozómové (tzv. malovací) a sondy pro jedinečné genové kopie. Sondy použité v kitu
Vermicon jsou celochromozómové.
Vícebarevná FISH je metoda založená na současné aplikaci dvou nebo více různě značených
sond na jednom mikroskopickém preparátu. Vizualizaci provádíme kombinací optických filtrů
o vhodných vlnových délkách. Existuje i technika kombinovaného značení, kdy různé sondy
značíme zároveň dvěma či více značícími molekulami v různých poměrech. Takto lze pomocí
tří fluorochromů rozlišit až sedm různých sond. Vícebarevná FISH umožňuje sledovat a
detekovat několik DNA sekvencí současně.
Fluorescenční proby využívá komerčně dostupný kit Vermicon Identification Technology, kde
principem této metody je navázání fluorescenční próby na gDNA bakterií. Po ozáření UV
světlem emitují záření (Obr. 1).
A, Volné sondy
B, Nenavázané sondy v buňce
C, Navázané sondy
Obr. 1 Princip kitu Vermicon (http://www.vermicon.de)
VIT – Vermicon Identification Technology - VIT-Bier plus L. brevis
Byl použit kit firmy Vermicon AG, který má schopnost detekovat rod Lactobacillus a
současně specificky Lactobacillus brevis v médiu. Je přímo vhodný pro pivovarskou
kontaminaci způsobenou tímto rodem. Před samotným obarvením ovšem musí předcházet
zkoncentrování vzorku. To se provádí buď přes filtry, které nepropustí bakterie, nebo
odstředění při vyšších otáčkách a odsátí supernatantu. Další možností je pomnožení bakterií ve
vhodném médiu tak, aby koncentrace vzrostla alespoň na 1000 KTJ (kolonií tvořící jednotky)
v 1 ml. Rychlost této metody je dána také tím, že se nepracuje s přesně definovaným
množstvím jak vzorku, tak ostatních chemikálií, ale jedná se o kapkovou metodu. Všechny
chemikálie, mezi které patří fixační roztok, barvící roztok, nebo promývací roztok, jsou
uzpůsobeny k použití v lahvičkách s kapátkem.
Další nezbytnou součástí kitu je sada podložních skel, boxy k inkubaci – reaktor
(Obr.2). Podložní sklo je rozděleno na tři pole ohraničená černou fólií. Každé z těchto polí
poskytuje informaci o stejném vzorku jednoho druhu.
Obr. 2 Součásti kitu Vermicon
Příprava vzorků
Inkubátor byl předehřán na 46 ± 2 oC a složka Breaker 2 byla rozmražována před samotným
pokusem
 Byl připraven vzorek s kulturou, která obvykle roste při 28°C po dobu nejméně 48
hodin. Část byla převedena do sterilní vialky na 1,5 – 2 ml.
 Vzorek byl odstředěn (při pokojové teplotě) po dobu 5 minut při 2 700 – 4000 RPM,
poté byl odstraněn supernatant tak, aby došlo k úplnému odstranění kapalné části.

Přidaly se čtyři kapky roztoku B2 k peletě, vzorek byl homogenizován. Došlo
k usmrcení bakterií.
Nanášení preparovaného vzorku a fixace

Podložní sklíčko bylo vloženo do víčka VIT- reaktoru (Obr. 3)
Obr. 3 Umístění podložního skla do víčka VIT reaktoru
 Pomocí pipety byla přidána jedna kapka (5 – 10 l) preparovaného vzorku na sklíčko se
třemi otvory. Inkubace proběhla v horizonální poloze při 46°C po dobu 15 až 30 minut,
nebo do úplného uschnutí.
 Dále se přidala kapka Breaker 2 do kažké jamky a takto se inkubovala na podložce
v horihontální poloze při pokojové teplotě po dobu 7 minut. (Ihned po použití je nutné
Breaker 2 uzavřít a vrátit zpět na mrazák).
 VIT reaktor byl naplněn destilovanou vodou po značku. Opatrně byl postaven na
podložku kolmo a ihned byl rozebrán. Voda byla vylita.
 Poté byla přídána jedna kapka roztoku B2 do jamky a v horizonální poloze proběhla
inkubace při 46 °C po dobu 10-15 minut nebo do kompletního vyschnutí bez VIT reaktoru.
Je-li potřeba, může být reaktor s fixovaným vzorkem uchován při 4 °C po dobu až 4 týdnů.
Kontakt
 Byl připraven promývací roztok Spotřeba na každou reakci je 30 ml roztoku D1,
naředěného 10x s destilovanou vodou.
 V průběhu kontaktu byl promývací roztok předehřívaný na 46 °C v uzavřené lahvi
v inkubátoru.
 Z části byla vložena komora do VIT-reaktoru (Obr. 4)
 Poté se přidalo asi 25 kapek roztoku C1 do komory VIT reaktoru a celá komora byla
zasunuta do VIT- reaktoru.
 Na sklíčko do jamky označené „ – “ . byla přidána 1 kapka negativní kontroly
 Na sklíčko do jamky označené „VIT“ byla přídána 1 kapka B-Lbr (green).
 Na sklíčko označené „+“. byla přidána 1 kapka pozitivní kontroly G (red)
 Pozorně bylo sklíčko vloženo horiontálně do VIT – reaktoru (Obr.5), reaktor byl
uzavřen a proběhla inkubace v horizontální poloze při 46°C po dobu 1,5 hodiny. Je nutné
zamezit kontaktu jednotlivých vzorků mezi sebou.
Obr. 4 Vložení komory do reaktoru
Obr. 5 Vložení sklíčka do reaktoru
Promývání






Opatrně byl otevřen VIT reaktor a vyndalo se sklíčko. (Pozor na slití různých jamek.)
Poté se jamky vyndaly z reaktoru a byly postaveny kolmo a reaktor byl naplněn
promývacím roztokem ke značce. Reaktor byl uzavřen v kolmé poloze a otočen do
horizontální polohy. Proběhla inkubace VIT reaktoru v této pozici 46 °C po dobu 15
minut.
VIT reaktor byl otevřen a vyndalo se sklíčko. Promývací roztok byl odstraněn
Podložní sklíčko bylo opláchnuto destilovanou vodou.
Podložní sklíčko bylo inkubováno v temnu při 46 °C, 15 minut nebo do kompletního
vyschnutí.
Poté byly přidány dvě malé kapky Finisher na sklíčko a bylo přiloženo krycí sklíčko.
Mikroskopické hodnocení
Jelikož se jedná o bakterie dlouhé 1-6µm, bylo nejvhodnější použít zvětšení 10x100 a imerzní
olej.Podložní sklo rozdělené do tří polí dává tyto výsledky:
 pole pozitivní kontrola - všechny gram-positivní bakterie ze vzorku svítí zeleně
 pole negativní kontrola - bakterie nesvítí ani červeně ani zeleně
 Pivo kazící mléčné bakterie svítí červeně, pouze Lactobacillus brevis svítí
červeně a zeleně.
Mikroskopování bylo provedeno na mikroskopu Olympus BX51. Tento typ disponuje
měnitelnými filtry. Také je u tohoto typu možnost snímání zorného pole pomocí kamery a
pořídit tak digitální záznam na počítači.L.brevis dává obraz 3 možných zorných polí v jiném
světle. Na prvním obrázku (Obr. 6) je Lactobacillus brevis v nativním preparátu. Zvětšení při
mikroskopování bylo vždy použito 10 x 100 s použitím imerzního oleje. Dalším obrázkem
(Obr.7) je L.brevis pod UV světlem a filtrem na zelenou fluorescenci. Ta je způsobena
barvivem fluoresceinem. Posledním ze série snímků je obrázek s nastaveným červeným filtrem
(Obr.8). Zde je fluorescence způsobena rhodaminem.
Obr. 6 Nativní preparát vzorku Lactobacillus brevis, zvětšení 10 x 100 imerze
Obr. 7 Preparát vzorku Lactobacillus brevis pod UV světlem se zeleným filtrem
Obr. 8 Preparát Lactobacillus brevis pod UV světlem s červeným filtrem
Literatura:
Fiala, J., Vohánka, J., Dostálek, P.: Determination of Lactobacillaceae by PCR methods.
Proceedings of the Congress - European Brewery Convention 30, 2005, 131/1-131/7.
Část B: Výroba piva
1.
Příprava mladiny
Výrobní zařízení: 1/4-provozní čtyřnádobová varna, vystírací káď, rmutovací pánev,
scezovací káď, mladinová pánev, měděné nádoby, 2-rmutový dekokční postup, ohřev
plynem, oddělení chmele na chmelovém cízu. Varna je umístěna v technologické hale
ÚKCHB, VŠCHT Praha
Suroviny:
voda
sladový šrot
hlávkový sušený chmel
chmelový granulát
sacharosa
Pracovní postup:
1/ Vystírání: V boileru se upraví teplota vody na 38 oC a přibližně 35 l se přepustí do
vystírací kádě. Za stálého míchání se vystře (při výrobě mladiny o původní koncentraci 11
%hm. se vystírá přibližně 10 kg sladového šrotu při 38 oC) a po řádném rozmíchání se
výsledný objem díla upraví na 45 litrů).
2/ Rmutování: 23 l vystírky se spustí jako první rmut na rmutovaní pánev. Rmut se pomalu
vyhřívá (l °C za l min) až na „první cukrotvornou“ teplotu 63 °C. Po dosažení této teploty
se zařadí prodleva 15 min. V průběhu zahřívání se v boileru přivede zbytek vody do varu a
přidá se ke zbytku vystírky v takovém množství, aby teplota vzrostla na 55 °C. Tuto
operaci nazýváme „zapářka“. Po prodlevě prvního rmutu opět pozvolna zvyšujeme teplotu
na 73 °C („druhá cukrotvorná“ teplota). Zde se rmut „podrží“ až do úplného zcukření. Při
použití kvalitních sladů zcukření proběhne do 15 minut. Po kontrole zcukření jodovou
zkouškou (viz. jodová zkouška), rmut pozvolna přivedeme do varu a 20 minut vaříme.
Povařený rmut se přečerpá zpět do vystírací kádě - teplota ve vystírací kádi pak musí být
v v rozsahu hodnot 62 °C až 65 °C. Po důkladném promíchání se spustí zvolené množství
díla do rmutovací pánve (v reálném případě 22 l). Druhý rmut se uvedenou rychlostí ohřeje
na 75 oC a nechá zcukřit. Dosažení úplného zcukření (doba je přibližně stejná jako u
prvního rmutu) ověříme jodovou zkouškou a rmut se pozvolna uvede do varu a 15 minut
povaří. Následně se spojí druhý rmut se zbytkem ve vystírací kádi ( teplota musí být
v rozsahu 73 oC – 78 oC) a celé dílo se přečerpá na scezovací káď.
3/ Scezování: Po 30 minutové prodlevě, při které se vytvoří sedimentací pluch filtrační
koláč, se dílo tzv. „podrazí“ (odpustí se kalný podíl a vrátí nad mláto). Když je stékající
sladina čirá, zahájí se scezování. V průběhu stékání předku se naplní boiler vodou, vyhřeje
na 75 oC a až se při stahování předku objeví na dně kádě povrch mláta, začne se
s „výstřelkováním“. Povrch mláta se skrápí ohřátou vodou. Je-li mláto potopeno, opatrně
se prokope jeho vrchní vrstva tak, aby se nenarušila vrstva spodní a pokračuje se ve
scezování. V této fázi již lze zatopit pod kotlem a ohřívat sladinku. Výstřelkování se
provádí buď na extrakt výstřelku (min 1% ), nebo na objem (v reálném případě).
4/ Chmelovar: Dávka chmele je závislá na obsahu hořkých látek a požadované hořkosti
vyráběného piva. Ke chmelení se používá sušený hlávkový chmel nebo chmelový granulát.
Nejvhodnější dávkování chmele je na tři dávky a to 40 % - 40 % - 20 %. Po ukončení
scezování se sladina přivede do varu. Cca 10 minut před dosažením bodu varu se přidá
první dávka chmele. Druhá dávka se přidává 30 minut po začátku chmelovaru a třetí
společně se sacharosou (v případě surogace) 10 minut před jeho skončením. Celý
chmelovar se provádí v mladinové pánvi a trvá 90 minut. Následuje kontrola lomu a
odměření objemu vystřelované horké mladiny. Odpar bývá 7 až 8 litrů. Objem horké
mladiny je cca 50 l.
5/ Chlazení a oddělení kalů: Na další nádobě, která je kombinací cízu a chladiče, se oddělí
chmelové mláto a mladina se ochladí na 7 oC. Při chlazení se změří orientačně stupňovitost
sacharometrem. Zde je poslední možnost naředit mladinu na požadovanou stupňovitost
převařenou vodou (v další fázi výroby již voda do českého piva voda při klasické
technologii nepatří).
Výpočet sypání:
Sypání je množství sladu (a jejich surogátů) použité pro várku. Závisí na extraktivnosti
zpracovávaných surovin.
S = V20 . E0
Rv
kde S je sypání sladu (kg
V20 je objem studené mladiny (V100 . 0,96)
E0
je koncentrace mladiny před čerpáním (% obj. = % hm. x hustota)
Rv je varní výtěžek (%), tj. extrakt použitého sladu v původní hmotě E zmenšený o
rozdíl extraktu mezi laboratoří a varnou
Jodová zkouška – kontrola zcukření: Připraví se 0,01 N roztok jodu a několik kapek se
přidá k malému množství zkoušeného rmutu. Pokud roztok zůstane žlutý, pokračuje se
dále ve výrobním postupu. Pokud jod zmodrá, není ještě všechen škrob obsažený ve
sladovém šrotu rozštěpen na jednoduché zkvasitelné sacharidy. V tomto případě se zvýší
teplota na 75 °C a pokračuje se v prodlevě až do úplného zcukření.
Procesu zakvašení předchází posouzení kvality kvasnic a stanoven zákvasné dávky
v závislosti na koncentraci mladiny. Připravená mladina se zchladí na 7 °C a oddělí se
jemné kaly (nejlépe po usazení stáhnout hadičkou) a zakvasí se pivovarskými kvasnicemi v
množství 250 ml hustých kvasnic na 50 litrů mladiny tak, aby po zakvašení byl počet buněk
(15 – 20). 106 buněk/ml (viz. dále Stanovení počtu buněk po zakvašení). Mladina se pak
nechá kvasit ve skleněné nádobě při teplotě 7 °C. Teplota je regulována temperací místnosti
– „spilky“. Po dvou dnech teplota mladiny vzroste intenzivním kvašením na 8 °C, po třech
dnech klesá opět na 7 °C. Obecně platí zásada - kolik % extraktu má mladina, tolik dní se
vede hlavní kvašení. Tuto dobu lze však ovlivnit zákvasnou dávkou, teplotou procesu a je
závislá na parametrech mladiny a kvalitě kvasnic. Kvasící pivo je třeba kontrolovat. Když
kvasnice sedají ke dnu a pivo se začíná čiřit a extrakt odpovídá 75 % dosažitelného
prokvašení mladiny, suduje se do čistých sudů případně PET lahví. Sudy s mladým pivem
se uloží do ležáckého sklepa, při teplotě 0,5 až 2 °C a nechají se po dobu 5 až 7 týdnů
dokvášet - zrát. V průběhu dozrávání se kontroluje tlak v sudu a udržuje se přibližně na 1,5
kPa.
2.
Mikrobiologická kontrola várečných kvasnic
Při odběru vzorků kvasnic je nutné zajistit odebrání průměrného tak, aby nedošlo k sekundární
kontaminaci. Vzorky se odebírají sterilně do sterilních nádobek (zkumavek, baněk) uzavřených
vhodnou zátkou. Zpracují se v nejkratší době po odebrání. Mikrobiologická kontrola zahrnuje
posouzení kvasnic podle makroskopických znaků, mikroskopické posouzení čistoty kvasnic,
stanovení počtu mrtvých buněk a stanovení kontaminujících (koliformních a mléčných)
bakterií
2.1
Posouzení kvasnic podle makroskopických znaků
Termín kvasnice se používá pro větší množství biomasy pivovarských kvasinek, pokud se
popisují jednotlivé buňky nebo jejich vlastností používá se termín kvasinky.
Prvními ukazateli kvality kvasnic bývá posouzení makroskopických, mikroskopických znaků a
celkové vyhodnocení znečištění kvasnic(„várečných“ - použitých na zakvašení). Jako hlavní
kvalitativní vlastnosti kvasnic se pak hodnotí jejich viabilita a vitalita. Termín viabilita nebo
počet viabilních buněk (viability count) označuje počet buněk v populaci, které jsou schopné
růstu a dalšího rozmnožování. Stanovuje se několika metodami s odlišným principem.
Nejpřesnější (ale i časově nejnáročnější) jsou metody založené na buněčné replikaci,
nejrozšířenější jsou metody založené na barvení a méně používané jsou metody jejichž
principem je měření obsahu některých buněčných složek, adenosin trifosfátu (ATP), či
redukované formy nikotinamid dinukleitidu (NADH).
Termín vitalita poukazuje na fyziologický stav populace nebo na její metabolickou aktivitu.
Vitalita se v laboratorních podmínkách nejčastěji sleduje testy založenými na metabolické
aktivitě kvasinek (acidifikační test, intraceluární pH, rychlost spotřeby kyslíku atd.) nebo
metodami založenými na měření některých buněčných složek jako jsou zásobní látky
(glykogen, trehalosa atd.) nebo ATP či NADH.
2.2
Stanovení vitality a viability kvasnic
Stanovení viability kvasnic barvícími technikami - Barvení methylenovou modří
Princip: Živé buňky kvasinek redukují alkalický roztok methylenové modři na bezbarvou
formu, mrtvé buňky kvasinek se barví modře. Přesnost stanovení závisí na pH, jehož optimum
pro reprodukovatelné stanovení je 9,5-10,5.
Materiál: Bürkerova počítací komůrka, methylenová modř, mikroskop
Pracovní postup: V kapce roztoku methylenové modře se rozmíchají kvasnice očkovací jehlou
nebo tenkou skleněnou tyčinkou tak, aby vznikl preparát s počitatelným množstvím buněk v
políčku Bürkerovy komůrky nebo v zorném poli. Po přikrytí krycím sklem se ihned spočítají
tmavě modře zbarvené buňky a ostatní kvasinky. Methylenová modř buňky usmrcuje a počet
mrtvých buněk s časem roste. Prohlédne se nejméně 20 políček a výsledek se vyjádří v
procentech mrtvých buněk z celkového počtu kvasinek. Metoda je spolehlivá, dodrží-li se
předepsané podmínky a pracuje-li se rychle. Kvasinky musí být v suspenzi dobře rozptýlené,
preparát musí mít předepsanou hustotu (100-200 buněk v zorném poli), jinak se získají chybné
výsledky. Násadní kvasnice mají obsahovat méně než 5 % mrtvých buněk
Smart K., A., Chambers K., M.: J. Am. Soc. Brew. Chem. 57 (1), 1999, s. 18
Stanovení viability kvasnic barvícími technikami - Barvení propidium jodidem s
vyhodnocením na průtokovém cytometru
Princip: Při průtokové cytometrii jsou jednotlivé buňky unášeny laminárním proudem
kapaliny do měrné cely kde je ozáří světelný zdroj, kterým je obvykle laserový paprsek přesně
definovaných parametrů. Světelný zdroj je zaostřen na proud kapaliny, nesoucí analyzovaný
vzorek. Světelný paprsek se při průchodu jednotlivými buňkami buť pohltí, rozptýlý nebo u
obarveného vzorku emituje fluorescenční záření měří se tedy veličiny: úhel rozptylu, snímaný
v přímém směru od světelného zdroje (forward angle – FSC), odpovídající velikosti buněk,
úhel rozptylu, snímaný pod úhlem 90° od světelného zdroje (side angle – SSC), popisující
granularitu buňky, a fluorescence pro různé vlnové délky (fluorescence je také snímána pod
úhlem 90° od světelného zdroje). Z těchto měřených veličin získáme informace o počtu
procházejících jedinců, jejich tvaru, velikosti, morfologii a vitalitě. Vzniklé signály jsou
jednotlivě zesíleny fotonásobiči, detekovány a registrovány pomocí pulzního analyzátoru
napětí. Buňky mohou být analyzovány při velmi vysokých rychlostech průchodu měrnou
celou, dosahujících až několik tisíc buněk za sekundu, avšak za optimální je považováno
rychlost v řádu stovek.
Výsledkem analýzy je histogram, který ukazuje rozložení jednotlivých měřených
parametrů v rámci buněčné populace. Jestliže se současně měří v jediné buňce více než jeden
parametr, lze výsledky vyjádřit též dvou nebo třídimenzionálně histogramem nebo bodovým
diagramem pro dvě charakteristiky. Každý bod diagramu odpovídá jedné měřené částici. Mezi
nejčastěji používaný bodový diagram v průtokové cytometrií patří tzv. dot plot diagram, který
udává závislost dvou korelujících parametrů (vlastností buněk), např. popisuje závislost
velikosti buněk (FSC) na jejich granularitě (SSC). Propidium jodidem se barví pouze živé
buňky, mrtvé ne. Poznámka: propidium jodid je chemikálie se silným karcinogenním
účinkem, proto je při manipulaci nezbytné používat chirurgické rukavice či jinou vhodnou
ochranu.
Zásobní roztok barviva (10 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), pracovní roztok
barviva (1 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), fyziologický fosfátový ústojný
roztok PBS, průtokový cytometr (Partec PAS III, výrobce: Partec, GmbH Germany), argoniontový laser, červený filtr FL3 nad 600nm.
Pracovní postup:
Z hodnocených kvasnic se do odeberou dva vzorky. V jednom se kvasinky po odstředění
usmrtí dvouhodinovou fixací v roztoku 70 % ethanolu a poté znovu odstředí a promyjí
fosfátovým pufrem. Ze vzorku se přidá několik kapek do měrné kyvety a ta se doplní do dvou
třetin fosfátovým pufrem. Do kyvety se nakonec přidá 5 μl barviva a roztok se řádně protřepe.
Po vlastní analýze na průtokovém cytometru popsaném výše se vyhodnotí intenzita
fluorescence mrtvých buněk. Ta samá procedura, s pochopitelným vynecháním fixačního
kroku, je provedena i s druhou částí vzorku. Buňky, které fluoreskují ve stejném rozmezí
intenzit jako u fixovaného vzorku jsou poté vyhodnoceny jako mrtvé.
Literatura: Hutter K., J., Schaefte J.: Monatsssch. Brauwiss. 50, 1997, s. 444
Howard M.Shapiro: Practical flow citometry. Wiley-Liss publication, 3rd ed., New York, 1995
2.3
Kontrola mikrobiální kontaminace
Fluorescenční proby využívá komerčně dostupný kit Vermicon Identification Technology, kde
principem této metody je navázání fluorescenční próby na gDNA bakterií. Po ozáření UV
světlem emitují záření (Obr. 1).
A, Volné sondy
B, Nenavázané sondy v buňce
C, Navázané sondy
Obr. 1 Princip kitu Vermicon (http://www.vermicon.de)
VIT – Vermicon Identification Technology - VIT-Bier plus L. brevis
Byl použit kit firmy Vermicon AG, který má schopnost detekovat rod Lactobacillus a současně
specificky Lactobacillus brevis v médiu. Je přímo vhodný pro pivovarskou kontaminaci
způsobenou tímto rodem. Před samotným obarvením ovšem musí předcházet zkoncentrování
vzorku. To se provádí buď přes filtry, které nepropustí bakterie, nebo odstředění při vyšších
otáčkách a odsátí supernatantu. Další možností je pomnožení bakterií ve vhodném médiu tak,
aby koncentrace vzrostla alespoň na 1000 KTJ (kolonií tvořící jednotky) v 1 ml. Rychlost této
metody je dána také tím, že se nepracuje s přesně definovaným množstvím jak vzorku, tak
ostatních chemikálií, ale jedná se o kapkovou metodu. Všechny chemikálie, mezi které patří
fixační roztok, barvící roztok, nebo promývací roztok, jsou uzpůsobeny k použití v lahvičkách
s kapátkem.
Další nezbytnou součástí kitu je sada podložních skel, boxy k inkubaci – reaktor
(Obr.2). Podložní sklo je rozděleno na tři pole ohraničená černou fólií. Každé z těchto polí
poskytuje informaci o stejném vzorku jednoho druhu.
Obr. 2 Součásti kitu Vermicon
Příprava vzorků
Inkubátor byl předehřán na 46 ± 2 oC a složka Breaker 2 byla rozmražována před samotným
pokusem
 Byl připraven vzorek s kulturou, která obvykle roste při 28°C po dobu nejméně 48
hodin. Část byla převedena do sterilní vialky na 1,5 – 2 ml.
 Vzorek byl odstředěn (při pokojové teplotě) po dobu 5 minut při 2 700 – 4000 RPM,
poté byl odstraněn supernatant tak, aby došlo k úplnému odstranění kapalné části.

Přidaly se čtyři kapky roztoku B2 k peletě, vzorek byl homogenizován. Došlo
k usmrcení bakterií.
Nanášení preparovaného vzorku a fixace

Podložní sklíčko bylo vloženo do víčka VIT- reaktoru (Obr. 3)
Obr. 3 Umístění podložního skla do víčka VIT reaktoru
 Pomocí pipety byla přidána jedna kapka (5 – 10 l) preparovaného vzorku na sklíčko se
třemi otvory. Inkubace proběhla v horizonální poloze při 46°C po dobu 15 až 30 minut,
nebo do úplného uschnutí.
 Dále se přidala kapka Breaker 2 do kažké jamky a takto se inkubovala na podložce
v horihontální poloze při pokojové teplotě po dobu 7 minut. (Ihned po použití je nutné
Breaker 2 uzavřít a vrátit zpět na mrazák).
 VIT reaktor byl naplněn destilovanou vodou po značku. Opatrně byl postaven na
podložku kolmo a ihned byl rozebrán. Voda byla vylita.
 Poté byla přídána jedna kapka roztoku B2 do jamky a v horizonální poloze proběhla
inkubace při 46 °C po dobu 10-15 minut nebo do kompletního vyschnutí bez VIT reaktoru.
Je-li potřeba, může být reaktor s fixovaným vzorkem uchován při 4 °C po dobu až 4 týdnů.
Kontakt
 Byl připraven promývací roztok Spotřeba na každou reakci je 30 ml roztoku D1,
naředěného 10x s destilovanou vodou.
 V průběhu kontaktu byl promývací roztok předehřívaný na 46 °C v uzavřené lahvi
v inkubátoru.
 Z části byla vložena komora do VIT-reaktoru (Obr. 4)
 Poté se přidalo asi 25 kapek roztoku C1 do komory VIT reaktoru a celá komora byla
zasunuta do VIT- reaktoru.
 Na sklíčko do jamky označené „ – “ . byla přidána 1 kapka negativní kontroly
 Na sklíčko do jamky označené „VIT“ byla přídána 1 kapka B-Lbr (green).
 Na sklíčko označené „+“. byla přidána 1 kapka pozitivní kontroly G (red)
 Pozorně bylo sklíčko vloženo horiontálně do VIT – reaktoru (Obr.5), reaktor byl
uzavřen a proběhla inkubace v horizontální poloze při 46°C po dobu 1,5 hodiny. Je nutné
zamezit kontaktu jednotlivých vzorků mezi sebou.
Obr. 4 Vložení komory do reaktoru
Obr. 5 Vložení sklíčka do reaktoru
Promývání






Opatrně byl otevřen VIT reaktor a vyndalo se sklíčko. (Pozor na slití různých jamek.)
Poté se jamky vyndaly z reaktoru a byly postaveny kolmo a reaktor byl naplněn
promývacím roztokem ke značce. Reaktor byl uzavřen v kolmé poloze a otočen do
horizontální polohy. Proběhla inkubace VIT reaktoru v této pozici 46 °C po dobu 15
minut.
VIT reaktor byl otevřen a vyndalo se sklíčko. Promývací roztok byl odstraněn
Podložní sklíčko bylo opláchnuto destilovanou vodou.
Podložní sklíčko bylo inkubováno v temnu při 46 °C, 15 minut nebo do kompletního
vyschnutí.
Poté byly přidány dvě malé kapky Finisher na sklíčko a bylo přiloženo krycí sklíčko.
Mikroskopické hodnocení
Jelikož se jedná o bakterie dlouhé 1-6µm, bylo nejvhodnější použít zvětšení 10x100 a imerzní
olej.Podložní sklo rozdělené do tří polí dává tyto výsledky:
 pole pozitivní kontrola - všechny gram-positivní bakterie ze vzorku svítí zeleně
 pole negativní kontrola - bakterie nesvítí ani červeně ani zeleně
 Pivo kazící mléčné bakterie svítí červeně, pouze Lactobacillus brevis svítí
červeně a zeleně.
Mikroskopování bylo provedeno na mikroskopu Olympus BX51. Tento typ disponuje
měnitelnými filtry. Také je u tohoto typu možnost snímání zorného pole pomocí kamery a
pořídit tak digitální záznam na počítači.L.brevis dává obraz 3 možných zorných polí v jiném
světle. Na prvním obrázku (Obr. 6) je Lactobacillus brevis v nativním preparátu. Zvětšení při
mikroskopování bylo vždy použito 10 x 100 s použitím imerzního oleje. Dalším obrázkem
(Obr.7) je L.brevis pod UV světlem a filtrem na zelenou fluorescenci. Ta je způsobena
barvivem fluoresceinem. Posledním ze série snímků je obrázek s nastaveným červeným filtrem
(Obr.8). Zde je fluorescence způsobena rhodaminem.
Obr. 6 Nativní preparát vzorku Lactobacillus brevis, zvětšení 10 x 100 imerze
Obr. 7 Preparát vzorku Lactobacillus brevis pod UV světlem se zeleným filtrem
Obr. 8 Preparát Lactobacillus brevis pod UV světlem s červeným filtrem
Literatura:
Fiala, J., Vohánka, J., Dostálek, P.: Determination of Lactobacillaceae by PCR methods.
Proceedings of the Congress - European Brewery Convention 30, 2005, 131/1-131/7.
3.
Rozbor mladiny
3.1
Stanovení pH a barvy mladiny
Princip: Hodnota pH má vliv při rmutování na enzymové procesy, především na štěpení
vysokomolekulárních látek, dále na rozpustnost dusíkatých a hořkých látek při chmelovaru a
na intenzitu přibarvené vyrážené mladiny. Mezi hodnotou pH mladiny a příslušného piva jsou
určité závislosti. U mladin s vyššími hodnotami pH obtížněji koagulují při varu
výšemolekulární dusíkaté látky a piva jsou náchylná k tvorbě koloidních zákalů.
Běžné hodnoty pH kongresní sladiny světlého sladu jsou 5,6 až 6,0. Běžné hodnoty předku
jsou 5,5 až 5,8. U sufigovaných várek může být 5,6 až 6,1. Vyrážená mladina má pH 5,2 až
5,6. Barva se stanovuje spektrofotometricky podle EBC ve zfiltrovaném vzorku při 430 nm
pH-metr, spektrofotometr, zařízení pro membránovou filtraci, membránové filtry (0,45 µm),
křemelina
Pracovní postup:
Vzorek se zfiltruje přes membránu (při hodnotě zákalu vyšší než 1 jednotka EBC s přídavkem
0,1 % křemeliny) a změří se absorbance při 430 nm. Barva vzorku se vypočte podle vztahu
B = 25 . f . A430
3.2
Stanovení extraktu mladiny
Princip: Extrakt mladiny tvoří rozpuštěné látky, které přešly do roztoku při rmutování a
varním procesu ze surovin (sladu, ječmene, škrobnatých a neškrobnatých náhražek, chmele a
chmelových preparátů. Ke stanovení extraktu se nějčastěji používají sacharometry, pyknometry
nebo denzitometry. Při pyknometrickém stanovení se vyhledá ke zjištěné relativní hustotě
příslušná hodnota hmotnostního zlomku extraktu, která se vyjadřuje v procentech na dvě
desetinná místa. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u
něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných
podmínek. Extrakt předku se pohybuje podle typu vyráběné mladiny v rozmezí 12 až 20 %.
Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně
stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek.
- Pyknometr podle Reischaiera s nálevkou a trubičkou na vyprazdňování
- Sušárna
- Ultratermostat (hrdlo pyknometru musí být nad značkou ponořeno ve vodě).
Pracovní postup:
Stanovení hmotnosti prázdného pyknometru:
Z vyčištěného pyknometru se odsaje vzduch, pak se propláchne methanolem nebo
acetonem a vysuší v sušárně. Po vysušení se dá do exsikátoru asi na 20 minut. Po
vychladnutí se temperuje 15 minut ve vážním prostoru analytických vah. Pak se zváží s
Stanovení vodní hodnoty pyknometru:
Pyknometr se naplní destilovanou vodou prostou oxidu uhličitého (provařenou).
Temperuje se 20 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C. Případné bublinky uvnitř
pyknometru se odstraní poklepem rukou na pyknometr. Kapilární trubičkou se odsaje z
hrdla kapalina asi l až 2 mm nad rysku. Zbytek se odsaje smotkem filtračního papíru přesně
po rysku (zaostří se) a současně se filtračním smotkem vysuší hrdlo pyknometru. Opět se
temperuje 5 minut. V případě změny objemu se pyknometr opět zaostří a to se opakuje tak
dlouho, až nenastává změna. Pak se pyknometr dokonale osuší, nechá se stát 15 minut v
prostoru analytické váhy a zváží se s přesností ± 0,0001 g.
Výpočet vodní hodnoty:
Vh = Pv - Pp
kde Vh je vodní hodnota pyknometru (g),Pv - hmotnost pyknometru naplněného
vodou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g).
Stanovení relativní hustoty mladiny:
Pyknometr se známou vodní hodnotou se propláchne třikrát mladinou a pak se naplní
pomocí nálevky tak, až přetéká (tím se odstraní bublinky tvořící se při plnění). Prudkým
pohybem se odstříkne nadbytek tekutiny, ne více než 5 mm od konce hrdla. Pyknometr se
vloží do ultratermostatu a temperuje se 20 minut při teplotě 20 °C ±0,1 °C. Zaostření
pyknometru je stejné jako při stanovení vodní hodnoty. Po osušení se pyknometr zváží s
Hm = Ps-Pp/Vh
kde
Hm je relativní hustota mladiny
Ps - hmotnost pyknometru naplněného mladinou (g),
Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g),
Vh - vodní hodnota pyknometru (g).
Výsledky relativní hustoty se udávají na pět desetinných míst extraktu při teplotě 20° C.
Příslušné hmotnostní zlomky extraktu jsou uvedeny v tabulce v tab. 7.1 (Pivovarskosladařská analytika, s. 850) Zdánlivé relativní hustoty extraktu.
3.3
Princip: Hořké látky, především iso--hořké kyseliny, se extrahují z okyselené mladiny (piva)
isooktanem a stanoví se spektrofotometricky
- Odstředivka, kyvety do odstředivky
- Zábrusové 100 ml baňky
- Třepačka o amplitudě 2 až 3 cm
- Spektrofotometr
- Isooktan (2,2,4-trimethylpentan), spektroskopicky čistý (absorbance změřená v lem
kyvetě proti destilované vodě při 275 nm musí být nižší než 0,005)
-Roztok kyseliny chlorovodíkové, c'(HCl) = 6 mol.l"1
Pracovní postup:
Zakalené vzorky mladiny (piva) se vyčeří odstředěním, k úpravě vzorku nelze použít filtrace. Z
piva se před analýzou odstraní bez ztráty pěny oxid uhličitý.
10 ml vzorku se odpipetuje do centrifugační kyvety přidá se 0,5 ml roztoku HC1, c = 6 mol/l,
dále 20 ml isooktanu a 2 až 3 skleněné kuličky. Centrifugační kyvety se uzavřou a třepou 15
minut při teplotě 20 °C na třepačce. Potom se obsah kyvet odstřeďuje 3 minuty při frekvenci
otáčení 3000 za minutu. Upravený způsob: 100 ml čirého vzorku, 0,5 ml roztoku HC1 (c = 6
mol/l), 20 ml isooktanu se dá do 100 ml baňky a třepe intenzivně na třepačce 5 minut. Změří se
absorbance isooktanového extraktu proti čistému isooktanu (téže kvality jako k extrakci
vzorku) v 1 cm křemenných kyvetách při 275 nm.
Jednotky hořkosti (JH) se vypočtou podle vztahu:
JH = 50 . A (10 ml vzorku)
A - absorbance isooktanového extraktu vzorku při 275 nm. Výsledky se uvádějí v celých
číslech bez desetinných míst.
Běžné hodnoty:
Mladina 20 až 60 JH podle druhu vyráběné mladiny a dávky chmele, pivo 10 až 40 JH
(jednotek hořkosti) podle typu piva, dávky chmele apod
4.
Procesu zakvašení předchází posouzení kvality kvasnic a stanoven zákvasné dávky v závislosti
na koncentraci mladiny. Připravená mladina se zchladí na 7 °C a oddělí se jemné kaly (nejlépe
po usazení stáhnout hadičkou) a zakvasí se pivovarskými kvasnicemi v množství 250 ml
hustých kvasnic na 50 litrů mladiny tak, aby po zakvašení byl počet buněk (15 – 20). 106
buněk/ml (viz. dále Stanovení počtu buněk po zakvašení). Mladina se pak nechá kvasit ve
skleněné nádobě při teplotě 7 °C. Teplota je regulována temperací místnosti – „spilky“. Po
dvou dnech teplota mladiny vzroste intenzivním kvašením na 8 °C, po třech dnech klesá opět
na 7 °C. Obecně platí zásada - kolik % extraktu má mladina, tolik dní se vede hlavní kvašení.
Tuto dobu lze však ovlivnit zákvasnou dávkou, teplotou procesu a je závislá na parametrech
mladiny a kvalitě kvasnic. Kvasící pivo je třeba kontrolovat. Když kvasnice sedají ke dnu a
pivo se začíná čiřit a extrakt odpovídá 75 % dosažitelného prokvašení mladiny, suduje se do
čistých sudů případně PET lahví. Sudy s mladým pivem se uloží do ležáckého sklepa, při
teplotě 0,5 až 2 °C a nechají se po dobu 5 až 7 týdnů dokvášet - zrát. V průběhu dozrávání se
kontroluje tlak v sudu a udržuje se přibližně na 1,5 kPa.
4.1
Stanovení pH mladiny, zdánlivého extraktu a počtu buněk ve vznosu
Hodnota pH výrazně ovlivňuje nejen chemické a biochemické procesy ve vodách, nýbrž i
stabilitu a aktivitu enzymů, zejména při rmutování má vliv na štěpení vysokomolekulárních
látek, na rozpustnost dusíkatých a hořkých látek při chmelovaru a na intenzitu přibarvení
vyrážené mladiny. U mladin s vyššími hodnotami pH obtížněji koagulují při varu
Stanovení pH:
Měření pH skleněnou elektrodou využívá vlastností skleněné membrány, na které se vytváří
potenciál, jehož velikost závisí na koncentraci vodíkových iontů v roztoku. Potenciál skleněné
elektrody se měří proti referentní kalomelové elektrodě
- pH-metr, skleněná a kalomelová elektroda
- Tlumivé roztoky o pH 4,00, 7,00 a 9,00
Pracovní postup:
V případě potřeby se elektroda i přístroj kalibrují s použitím tlumivého roztoku, jehož hodnota
je blízká měřenému pH. Při měření pH vzorku se elektroda opláchne a ponoří do
promíchaného vzorku a odečítá po ustálení. pH se má změřit ihned po odběru vzorku, není-li to
možné, odebere se plná vzorkovnice a uloží se v chladnu.
Výsledky se udávají s přesností na 0,1 až 0,05 pH podle typu použitého přístroje.
Běžné hodnoty:
Předek
5,5 – 5,8
Vyrážená mladina
5,2 – 5,6
Světlé pivo
4,1 – 4,8
Tmavé pivo
4,0 – 4,8
Dia pivo
4,0 – 4,8
PITO
4,4 - 5,4
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252,
Stanovení zdánlivého extraktu:
Princip:
Extrakt mladiny tvoří rozpuštěné látky, které přešly do roztoku při rmutování a varním procesu
ze surovin (sladu, ječmene, škrobnatých a neškrobnatých náhražek, chmele a chmelových
preparátů. Ke stanovení extraktu se nějčastěji používají sacharometry, pyknometry nebo
denzitometry. Při pyknometrickém stanovení se vyhledá ke zjištěné relativní hustotě příslušná
hodnota hmotnostního zlomku extraktu, která se vyjadřuje v procentech na dvě desetinná
místa. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl
přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek.
Extrakt předku se pohybuje podle typu vyráběné mladiny v rozmezí 12 až 20 %.
- Sušárna
Pracovní postup:
Z vyčištěného pyknometru se odsaje vzduch, pak se propláchne methanolem nebo acetonem a
vysuší v sušárně. Po vysušení se dá do exsikátoru asi na 20 minut. Po vychladnutí se temperuje
15 minut ve vážním prostoru analytických vah. Pak se zváží s přesností ± 0,0001 g.
Pyknometr se naplní destilovanou vodou prostou oxidu uhličitého (provařenou). Temperuje se
20 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C. Případné bublinky uvnitř pyknometru se odstraní
poklepem rukou na pyknometr. Kapilární trubičkou se odsaje z hrdla kapalina asi l až 2 mm
nad rysku. Zbytek se odsaje smotkem filtračního papíru přesně po rysku (zaostří se) a současně
se filtračním smotkem vysuší hrdlo pyknometru. Opět se temperuje 5 minut. V případě změny
objemu se pyknometr opět zaostří a to se opakuje tak dlouho, až nenastává změna. Pak se
pyknometr dokonale osuší, nechá se stát 15 minut v prostoru analytické váhy a zváží se s
Vh = Pv - Pp
kde Vh je vodní hodnota pyknometru (g),Pv - hmotnost pyknometru naplněného vodou (g), Pp
- hmotnost prázdného pyknometru (g).
Pyknometr se známou vodní hodnotou se propláchne třikrát mladinou a pak se naplní pomocí
nálevky tak, až přetéká (tím se odstraní bublinky tvořící se při plnění). Prudkým pohybem se
odstříkne nadbytek tekutiny, ne více než 5 mm od konce hrdla. Pyknometr se vloží do
ultratermostatu a temperuje se 20 minut při teplotě 20 °C ±0,1 °C. Zaostření pyknometru je
stejné jako při stanovení vodní hodnoty. Po osušení se pyknometr zváží s přesností ± 0,0001 g.
Hm = Ps-Pp/Vh
kde
Příslušné hmotnostní zlomky extraktu jsou uvedeny v tabulce v tab. 7.1 (Pivovarsko-sladařská
analytika, s. 850) Zdánlivé relativní hustoty extraktu.
Stanovení počtu buněk ve vznosu:
Běžně používaným postupem je přímé počítání v Bürkerově komůrce, další možnosti jsou
nefelometrické měření intenzity zákalu nebo měření počtu buněk na průtokovém citometru
Přímé počítání buněk v Bürkerově počítací komůrce.
Materiál: Počítací komůrka, mikroskop.
Postup práce:
Do středu komůrky se pipetou nanese kapka vzorku, ihned přikryje krycím sklíčkem a
komůrka se přenese na stolek mikroskopu. Po chvíli, až kvasinky klesnou na dno komůrky, se
při vhodném zvětšení (500 až 800 krát) počítají buňky v políčkách komůrky. Buňky se počítají
ve větším počtu políček (alespoň 20 polí), buňky ležící na hranách se počítají jen jednou.
Mateřské a dceřinné buňky (i neoddělené) kvasinek se počítají jako dvě buňky, pučící buňka
jako jedna. Z průměrného počtu buněk v jednom políčku se vypočte jejich koncentrace v l ml
suspenze. Průměrný počet buněk v políčku se vydělí jeho objemem a přepočte na l ml. V praxi
se přepočet zahrne do tzv. konstanty komůrky, kterou se násobí přímo průměrný obsah
mikroorganismů v l políčku.
5.
Dokvašování piva
5.1
Stanovení pH, zdánlivého extraktu a obsahu vicinálních diketonů v mladém pivu
Stanovení pH
Hodnota pH výrazně ovlivňuje nejen chemické a biochemické procesy ve vodách, nýbrž i
stabilitu a aktivitu enzymů, zejména při rmutování má vliv na štěpení vysokomolekulárních
látek, na rozpustnost dusíkatých a hořkých látek při chmelovaru a na intenzitu přibarvení
vyrážené mladiny. U mladin s vyššími hodnotami pH obtížněji koagulují při varu
Stanovení pH:
Měření pH skleněnou elektrodou využívá vlastností skleněné membrány, na které se vytváří
potenciál, jehož velikost závisí na koncentraci vodíkových iontů v roztoku. Potenciál skleněné
elektrody se měří proti referentní kalomelové elektrodě
- pH-metr, skleněná a kalomelová elektroda
- Tlumivé roztoky o pH 4,00, 7,00 a 9,00
Pracovní postup:
V případě potřeby se elektroda i přístroj kalibrují s použitím tlumivého roztoku, jehož hodnota
je blízká měřenému pH. Při měření pH vzorku se elektroda opláchne a ponoří do
promíchaného vzorku a odečítá po ustálení. pH se má změřit ihned po odběru vzorku, není-li to
možné, odebere se plná vzorkovnice a uloží se v chladnu.
Výsledky se udávají s přesností na 0,1 až 0,05 pH podle typu použitého přístroje.
Běžné hodnoty:
Předek
5,5 – 5,8
Vyrážená mladina
5,2 – 5,6
Světlé pivo
4,1 – 4,8
Tmavé pivo
4,0 – 4,8
Dia pivo
4,0 – 4,8
PITO
4,4 - 5,4
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252,
Stanovení zdánlivého extraktu:
Princip: Extrakt mladiny tvoří rozpuštěné látky, které přešly do roztoku při rmutování a
varním procesu ze surovin (sladu, ječmene, škrobnatých a neškrobnatých náhražek, chmele a
chmelových preparátů. Ke stanovení extraktu se nějčastěji používají sacharometry, pyknometry
nebo denzitometry. Při pyknometrickém stanovení se vyhledá ke zjištěné relativní hustotě
příslušná hodnota hmotnostního zlomku extraktu, která se vyjadřuje v procentech na dvě
desetinná místa. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u
něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných
podmínek. Extrakt předku se pohybuje podle typu vyráběné mladiny v rozmezí 12 až 20 %.
- Sušárna
Pracovní postup:
Z vyčištěného pyknometru se odsaje vzduch, pak se propláchne methanolem nebo acetonem a
vysuší v sušárně. Po vysušení se dá do exsikátoru asi na 20 minut. Po vychladnutí se temperuje
15 minut ve vážním prostoru analytických vah. Pak se zváží s přesností ± 0,0001 g.
Pyknometr se naplní destilovanou vodou prostou oxidu uhličitého (provařenou). Temperuje se
20 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C. Případné bublinky uvnitř pyknometru se odstraní
poklepem rukou na pyknometr. Kapilární trubičkou se odsaje z hrdla kapalina asi l až 2 mm
nad rysku. Zbytek se odsaje smotkem filtračního papíru přesně po rysku (zaostří se) a současně
se filtračním smotkem vysuší hrdlo pyknometru. Opět se temperuje 5 minut. V případě změny
objemu se pyknometr opět zaostří a to se opakuje tak dlouho, až nenastává změna. Pak se
pyknometr dokonale osuší, nechá se stát 15 minut v prostoru analytické váhy a zváží se s
Vh = Pv - Pp
kde Vh je vodní hodnota pyknometru (g),Pv - hmotnost pyknometru naplněného vodou (g), Pp
- hmotnost prázdného pyknometru (g).
Pyknometr se známou vodní hodnotou se propláchne třikrát mladinou a pak se naplní pomocí
nálevky tak, až přetéká (tím se odstraní bublinky tvořící se při plnění). Prudkým pohybem se
odstříkne nadbytek tekutiny, ne více než 5 mm od konce hrdla. Pyknometr se vloží do
ultratermostatu a temperuje se 20 minut při teplotě 20 °C ±0,1 °C. Zaostření pyknometru je
stejné jako při stanovení vodní hodnoty. Po osušení se pyknometr zváží s přesností ± 0,0001 g.
Hm = Ps-Pp/Vh
kde
Příslušné hmotnostní zlomky extraktu jsou uvedeny v tabulce v tab. 7.1 (Pivovarsko-sladařská
analytika, s. 850) Zdánlivé relativní hustoty extraktu.
Stanovení obsahu vicinálních diketonů
Tvorba vicinálních diketonů při kvašení mladiny souvisí se syntézou valinu a isoleucinu.
Důležitými meziprodukty této syntézy jsou 2-acetolaktát a 2-acetohydroxybutyrát, z kterých
oxidativní dekarboxylací vznikají diacetyl a 2,3-pentadion. Obě sloučeniny mají velký význam
ze senzorického hlediska, protože při překročení prahové koncentrace vnímání vyvolávají
nežádoucí změny aromátu piva.
Stanovení vicinálních diketonů se provádí metodami spektrofotometrickými (EBC) a
metodami plynové chromatografie a kapalinové
Princip spektrofotometrické metody podle Esera
Vicinální diketony se z analyzovaného piva oddestilují, destilát se smísí s roztokem ofenylendiaminu a množství vzniklých derivátů chinoxalinu se měří spektrofotometricky při
vlnové délce 335 nm.
- Destilační přístroj pro stanovení dusíku podle Parnase
- Spektrofotometr
- Roztok kyseliny chlorovodíkové, c(HCl) = 4 mol.l-1.
- Roztok o-fenylendiaminu v roztoku kyselině chlorovodíkové o koncentraci l % (w/v),
který se připravuje každý den čerstvý a uchovává se v temnu.
Pracovní postup:
Do kádinky o objemu 100 ml se odváží 100 g vychlazeného piva a kvantitativně se přeleje do
destilační baňky Parnasova přístroje. Destilační přístroj je předem vyhřát. Potom se zahájí
destilace takovou rychlostí, aby se nadestilovalo 25 ml za 2 minuty. Destilát se jímá do
odměrné baňky o objemu 25 ml. Z destilátu se po promíchání odpipetuje 10 ml do dvou
Erlenmeyerových baněk o objemu 50 ml, do jedné se přidá 0,5 ml roztoku o-fenylendiaminu a
do druhé 2,5 ml roztoku kyseliny HC1. Obě baňky se uzavřou zábrusovou zátkou, promíchají
se a uloží se na 30 minut do temna. Baňka bez o-fenylendiaminu se použije jako slepý pokus.
Po uplynutí reakční doby se přidají do baňky s o-fenylendiaminem 2 ml roztoku HC1 a ihned
se změří absorbance v 2 cm kyvetách při vlnové délce 335 nm proti slepému pokusu.
Koncentrace vicinálních diketonů se vypočte vynásobením zjištěné absorbance součinitelem
1,2. Výsledky se uvádějí v mg/kg nebo mg/l po přepočtu na dvě desetinná místa. Při
koncentracích vyšších než 0,25 mg/kg se již výrazně uplatňuje negativní vliv vicinálních
diketonů na aroma a chuť piva.
Poznámka: Spektrofotometrickou metodou nelze diferencovat obsah diacetylu od obsahu 2,3pentadionu.
Literatura: Basařová G.: -sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 770
6.
Analytické hodnocení hotového piva
6.1
Stanovení zdánlivého a skutečného extraktu, obsahu alkoholu a původní
koncentrace mladiny
Stupňovitost piva vyjádřená v procentech je procentický obsah extraktu původní mladiny ze
které se pivo vyrobilo před zakvašením. Zdánlivý extrakt Ez piva je extrakt stanovený v tomto
nápoji sacharometricky nebo pyknometricky po jeho zbavení oxidu uhličitého. Skutečný
extrakt -Es je nezkvašený extrakt piva, který se stanoví sacharometricky nebo pyknometricky
po oddestilování alkoholu a doplnění destilovanou vodou na původní hmotnost vzorku.
Alkohol A se stanoví v destilátu pyknometricky.
Mezi zdánlivým extraktem, skutečným extraktem, obsahem alkoholu v pivu a extraktem
původní mladiny jsou určité vztahy, které zpracoval Balling do nauky o attenuaci a vymezil
význam termínu prokvašení piva. Velký Ballingův vzorec pro výpočet extraktu původní
mladiny (%):
p
(2,0665 * A  ES ) *100
100  1,0665 * A
kde
A je alkohol (% hm)
Es - skutečný extrakt
K orientačnímu výpočtu extraktu původní mladiny, ze které je pivo vyrobeno, se
používá tzv. malý Ballingúv vzorec:
p
kde
ES  EZ
 ES
q
q je attenuační koeficient uvedený v pivovarských tabulkách
Ez - zdánlivý extrakt
ES – skutečný extrakt
Ve starší literatuře se používá označení pro zdánlivý extrakt Ez = m, pro skutečný extrakt
Es = n.
Princip destilační metody:
Z naváženého vzorku piva se vydestiluje alkohol, destilační zbytek po oddestilování alkoholu
se použije ke stanovení skutečného extraktu a z obou získaných údajů se vypočte hmotnostní
zlomek konvenčního extraktu
- Pyknometry typu Reischauer, 50 ml
- Temperovací lázeň
- Třepačka
- Destilační přístroj
- Skládané filtry
Pracovní postup:
Vzorek piva (300 až 500 ml) se vytemperuje v lázni na teplotu 20 °C a zbaví se oxidu
uhličitého. Potom se pivo přefiltruje přes suchý skládaný filtr, aby se zbavilo pěny. Prvních asi
50 ml filtrátu se vyleje.
Do vytárované (zvážené) destilační baňky o objemu 300 ml se naváží 100 g piva (nejvýše s
chybou 0,1 g) zbaveného oxidu uhličitého a přidá se 50 ml destilované vody. Do zvážené
předlohy se dá předem 5 až 10 ml destilované vody. Destiluje se zprvu za slabého zahřívání
(aby se pěna nedostala do přestupníku) a po uvedení do rovnoměrného varu se zahřívání zesílí.
Teplota vytékající vody z chladiče nesmí být vyšší než 25 °C. Destilace se ukončí po
nadestilování 85 až 90 ml (při rovnoměrném varu za 30 až 60 minut). Potom se konec chladiče
zasunutého v předloze opláchne malým množstvím destilované vody do předlohy a její obsah
se dováží vodou na 100,0 g. Relativní hustota destilátu se stanoví pyknometricky.
Zbytek v destilační baňce, který zůstal po oddestilování alkoholu, se ochladí na teplotu 20 °C a
dováží se destilovanou vodou na původní hmotnost 100,0 g. Po promíchání se stanoví relativní
hustota roztoku pyknometricky. Klky vzniklé při destilaci alkoholu se neodstraňují.
Jestliže se překročí původní hmotnost 100,0 g při dovažování destilátu nebo zbytku po
destilaci, musí se vypočítat z příslušných hodnot korekční součinitel.
Pro zdánlivý extrakt, který představuje extrakt piva po odstranění oxidu uhličitého, nebyla
zatím v upravené normě zavedena nová terminologie. U vytřepaného vzorku piva se stanoví
pyknometricky jeho relativní hustota a v tabulce se vyhledá odpovídající hodnota
hmotnostního zlomku extraktu.
Relativní hustota destilátu, zbytku po destilaci a zdánlivého extraktu se vypočte podle vztahu:
d 20/ 20 
m3  m1
m2  m1
kde d20/20 je relativní hustota,
m1 - hmotnost prázdného pyknometru (g),
m2 - hmotnost pyknometru s vodou (g),
m3 - hmotnost pyknometru s destilátem, zbytkem po destilaci nebo s vytřepaným
pivem (g).
Ke zjištěné hodnotě relativní hustoty destilátu, zbytku po destilaci nebo vytřepaného piva se
vyhledá v příslušných tabulkách údaj odpovídající hmotnostnímu zlomku alkoholu (WA)
hmotnostnímu zlomku skutečného extraktu (Wn ) nebo zdánlivému extraktu Ez(m).
Výsledky obou hmotnostních zlomků (WA,Wn ) a zdánlivého extraktu (Ez) se uvádějí v
procentech na dvě desetinná místa. Konečný výsledek je aritmetickým průměrem výsledků
dvou paralelních stanovení. Rozdíl mezi dvěma stanoveními nemá být větší než 0,06 % pro
WA, pro Wn 0,03 % a pro zdánlivý extrakt 0,02 %.
Hmotnostní zlomek konvenčního extraktu (WP), dříve původní koncentrace mladiny, se
vypočte podle Ballingova vzorce:
WP 
(2,0665 * WA  Wn ) *100
100  1,0665 * WA
kde WP je hmotnostní zlomek konvenčního extraktu (%),
WA - hmotnostní zlomek alkoholu (%),
WN - hmotnostní zlomek skutečného extraktu (%),
2,0665 a 1,0665 - koncenční konstanty podle Ballinga.
Výsledky hmotnostního zlomku konvenčního extraktu se uvádějí v procentech na jedno
desetinné místo po zaokrouhlení. Rozdíl mezi dvěma stanoveními nemá být větší než 0,03 %
(vztahuje se k zaokrouhleným výsledkům).
Zdánlivé a skutečné prokvašení se vypočte podle vztahu;
PZ 
WP  EZ
*100
WP
PS 
WP  Wn
*100
WP  Wn
kde PZ, je zdánlivé prokvašení (%),
PS - skutečné prokvašení (%),
WP - hmotnostní zlomek konvenčního extraktu (%),
Wn - hmotnostní zlomek skutečného extraktu (%),
EZ - zdánlivý extrakt piva (%).
Výsledky zdánlivého a skutečného prokvašení se uvádějí v procentech na jedno desetinné
místo.
6.2
Stanovení sacharidů metodou HPLC
Princip: Stanovení sacharidů metodou HPLC-RIDK. Mono- a oligosacharidy obsažené ve
sladině, mladině, případně hotovém pivu se dělí na ionexové koloně v Ag+ cyklu a detekují
refraktometricky.
kapalinový chromatograf Agilent 1100 s refraktometrickým detektorem
kolona Phenomenex Rezex RSO Oligosacharides 200x10 mm s předkolonkou
mikrofiltr s acetátcelulosovými filtry (0,45m)
třepačka
Chromatografické podmínky:
mobilní fáze:
odplyněná demineralizovaná voda
teplota kolony:
80C
průtok mob. fáze:
0,4 ml/min
Chemikálie:
glukóza, fruktóza a maltóza (vše p.a.)
Software:
Agilent Chemstation
Pracovní postup:
Pro kalibraci je třeba připravit 3 kalibrační roztoky maltózy, glukózy a fruktózy
v koncentracích 1, 2 a 5 g/litr. Vzorek se přefiltruje za pomocí mikrofiltru, v případě
prokvašené mladiny a hotového piva je třeba vzorek též předem vytřepat po dobu 15 min.
Následně se vzorek převede do vialky v autosampleru, další postup je již automatizován a řízen
softwarově. Sacharidy se na koloně dělí podle své molekulové hmotnosti a z kolony jsou
vymývány sestupně podle počtu glukózových jednotek, manosacharidy pak v pořadí
glukóza,fruktóza. Výsledky jsou vyhodnoceny pomocí kalibračních křivek, přičemž v případě
maltoriózy a vyšších sacharidů se používá kalibrační křivka maltózy. Výsledky se obvykle
vyjadřují v g/l a pohybují se v rozmezí 1-5 g/l u piv a 1-80 g/l u mladin a sladin (záleží na
původní koncentraci extraktu a použité technologii).
Literatura: Ondroušek, S., Dostálek, P.: Vliv technologie na vznik a využití sacharidů při
výrobě mladiny a piva, Kvasny Prum. 33(11), 1987, 322-5.
6.3
Princip: Hořké látky, především iso--hořké kyseliny, se extrahují z okyselené mladiny (piva)
isooktanem a stanoví se spektrofotometricky
- Odstředivka, kyvety do odstředivky
- Zábrusové 100 ml baňky
- Třepačka o amplitudě 2 až 3 cm
- Spektrofotometr
- Isooktan (2,2,4-trimethylpentan), spektroskopicky čistý (absorbance změřená v lem
kyvetě proti destilované vodě při 275 nm musí být nižší než 0,005)
-Roztok kyseliny chlorovodíkové, c'(HCl) = 6 mol.l"1
Pracovní postup:
Zakalené vzorky mladiny (piva) se vyčeří odstředěním, k úpravě vzorku nelze použít filtrace. Z
piva se před analýzou odstraní bez ztráty pěny oxid uhličitý.
10 ml vzorku se odpipetuje do centrifugační kyvety přidá se 0,5 ml roztoku HC1, c = 6 mol/l,
dále 20 ml isooktanu a 2 až 3 skleněné kuličky. Centrifugační kyvety se uzavřou a třepou 15
minut při teplotě 20 °C na třepačce. Potom se obsah kyvet odstřeďuje 3 minuty při frekvenci
otáčení 3000 za minutu. Upravený způsob: 100 ml čirého vzorku, 0,5 ml roztoku HC1 (c = 6
mol/l), 20 ml isooktanu se dá do 100 ml baňky a třepe intenzivně na třepačce 5 minut. Změří se
absorbance isooktanového extraktu proti čistému isooktanu (téže kvality jako k extrakci
vzorku) v 1 cm křemenných kyvetách při 275 nm.
Jednotky hořkosti (JH) se vypočtou podle vztahu:
A - absorbance isooktanového extraktu vzorku při 275 nm. Výsledky se uvádějí v celých
číslech bez desetinných míst.
Běžné hodnoty:
Mladina 20 až 60 JH podle druhu vyráběné mladiny a dávky chmele, pivo 10 až 40 JH
(jednotek hořkosti) podle typu piva, dávky chmele apod
6.4
Upravená metodika podle Analytica-EBC, Method 7.7
Princip:
Chmel, chmelové granule jsou extrahovány směsí ether/methanol a kyselinou
chlorovodíkovou.  a -kyseliny chmele rozpuštěné v etherové fázi jsou rozděleny pomocí
chromatografie na reverzní fázi se spektrofotometrickou detekcí při 314 nm.
Chemikálie:
 Diethylether, prostý peroxidů, p.a.
 Methanol, p.a.
 Methanol pro HPLC super gradient
 Kyselina fosforečná, 85%,  = 1,71
 Kyselina chlorovodíková, c(HCl) = 0,1 mol/l
 Eluční činidlo A: methanol/millipore voda/fosforečná kyselina v poměru 85 : 17 : 0,25
(v/v/v) cca 250 ml na 1 vzorek chmele (6 nástřiků) a standard (4 nástřiky)
 Eluční činidlo B: millipore voda (používá se pouze se Shutdown metodou!!!)
 Standardní chmelový extrakt se známým množstvím  a -kyselin (Labor Veritas,
Zürich, Switzerland), používá se jako externí standard, skladování při -18 ˚C v mrazáku
v pivovarské laboratoři, stabilita 1 rok
Přístroje a materiál:











Váhy AND
Třepačka (oranžová)
Ultrazvuková lázeň (hladina vody po naplnění cca 3 cm pod okraj)
Skleněná 250 ml láhev se závitem, gumovým tešněním a hliníkovým víčkem (pozn.: po
práci víčko a těsnění ponořte do teplé vody s Jarem)
Odměrné baňky 50 ml a 100 ml
Pipeta Biohit na 2x 5 ml
Pipeta na ether Brand handy step s 50 ml zásobníkem (krok 5)
Odměrný válec na těkavé kapaliny 100 ml
HPLC Waters W2690 s PDA detektorem W2996
HPLC kolona Waters Nova-Pak 250 x 4.6 mm, C18 s guard kolonkou nebo
Phenomenex Gemini 250 x 2.0 mm, C18 s guard kolonkou. Použití této HPLC-MS
kolony diskutovat s Ing. Dostálkem (je u ní potřeba dávat větší pozor na čistotu
rozpouštědel, nastřikovaná množství a tlaky).
Bomba s N2 na převrstvení
Pracovní postup:
Příprava externího standardu
Navažte 0,5 g standardního extraktu (mcs) do 50 ml kádinky (vraťte standard do
mrazáku) a přidejte 30 ml methanolu a rozpusťte pomocí ultrazvuku. Převeďte roztok extraktu
do 100 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Uzavřete baňku a vzniklý roztok
opatrně promíchejte. Z tohoto roztoku odpipetujte 10 ml do 50 ml odměrné baňky a doplňte po
rysku methanolem a promíchejte. Případný zákal odstraňte filtrací přes membránu 0,45 m
(Millipore). Roztok je připraven jako vzorek pro stanovení pomocí HPLC a metody externího
standardu. Skladujte tento roztok v lednici, převrstvěte jej dusíkem a chraňte jej před světlem
alobalem. Roztok je stabilní 24 hodin. Odpipetujte cca 1 ml do vialky s víčkem a těsním
(Waters) a vložte ji do karuselu HPLC autosampleru a pozici si zazanamenejte, budete ji
potřebovat při vyplňování tabulky pro nástřik vzorků .
Pozn.: Nastřikujte vzorek standardu nejméně 2krát před a 2krát po reálných vzorcích, stačí
opakovaný nástřik z jedné vialky.
Příprava vzorků chmele
Rozmělněte vzorek chmele či chmelových granulí v laboratorním mlýnku. Doba mletí 2
minuty. Každý vzorek chmele připravte 3krát k nástřiku (3x extra navážka a extrakce). Navažte
přesně přibližně 10 g jemně namletého chmele (ms) do 250 ml skleněné láhve se závitem.
Přidejte 20 ml methanolu a 100 ml diethyletheru. Zavřete opatrně láhev víčkem s gumovým
těsněním a intenzivně třepejte 30 minut na třepačce umístěné v digestoři. Poté opatrně otevřete
láhev (pracujte v digestoři), přidejte 40 ml 0,1 mol/l HCl. Opatrně uzavřete láhev a třepejte
nejméně 10 minut při optimálně intenzitě (tak aby extrakční činidlo nesmáčelo gumové
těsnění). Nechte láhev stát 10 minut aby se oddělili obě fáze. Opatrně odpipetujte 5,0 ml
etherové fáze pipetou Brand handy step do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku
methanolem. Opatrně promíchejte. Odpipetujte cca 1 ml do vialkek s víčky a těsněním
(Waters) a vložte je do karuselu HPLC autosampleru, pozici si zaznamenejte. Případný zákal
zfiltrujte pomocí 0,45 m či 0,22 m mikrofiltru a stříkačky.
Chromatografické stanovení




V okně nastavte vlevo metodu „EBC_7_7“ a vpravo chromatografický systém „Aliance
PDA“ pokud budete analyzovat. Pozn.: Pokud jen vyhodnocujete výledky tak nastavte
„No system“. Překontrolujte správnost nastavení metody. Klikněte na záložku „View
Method“ a nahoře v lište „File“, pak „Open“ … method set EBC77_1. Pak přepněte
v záložce „View Method“ na „Instrument“ a klikněte na tlačítko „W2690/5“ a
zkontrolujte průtok mobilní fáze v záložce „Flow“ (Isocratic, Total Flow 0.550, %A
100.0, Low Limit 50.0 a High Limit 3500.0). Zároveň překontrolujte, že eluční roztok
je v láhvi A, a že je v něm zcela ponořena hadička s fritou, popsaná jako „Solvent A“!!!
Poté klikněte na tlačítko „W2996“ a překontrolujte nastavení PDA detektoru (2D Data
Collection, Method channel lambda 314.0, Method channel bandwith 1.2, Sampling
Rate 1.0 a zaškrtnout „Digital Filter“)
Před vlastní analýzou je potřeba „zavodnit“cestu A pomocí stříkačky a programu.
Eluční činidlo přefiltrujte přes 0,45 m acetát-celulosovou membránu Sartorius a
nalijte do čistě vymyté 1 l láhve, popište složením mobilky, jménem a datem. Láhev
dobře utěsněte parafínovou folií. Po najetí základní obrazovky na Allianci stiskněte
„Menu/Status“ poté „Direct Functions“ a dále na „Dry Prime“, otevřete cestu A
tlačítkem „Open A“ , povolte zavodňovací šroub (otevřít spodní dvířka a povolit
doleva šroub mezi pumpami) a ručně zavodněte cestu stříkačkou (stačí cca 10 ml), poté
utáhněte šroub a stiskněte tlačítko „Continue“. Vyčkejte na promytí cest. Následně
stiskněte „Direct Functions“, zkontrolujte máte-li v láhvi za přístrojem (vedou k ní dvě
hadičky „zelená“ a „Seal wash in“) dostatek oplachové kapaliny (30-50% methanol) a
poté stiskněte tlačítko „Wet Prime“. Vyčkejte na promytí součástí přístroje.
„Equilibrujte“ kolonu elučním činidlem A nejméně 30 min před nastříknutím vzorků.
Přepněte se do záložky „Run Samples“, pokud není oranžové tlačítko „View
Acquisition“, tak na něj klikněte.
Stiskněte tlačítko „Press to equilibrate
system/monitor baseline“, a zadejte Instrument Method „ebc77“ a stiskněte tlačítko
„Equilibrate/Monitor“. Přepnutím tlačítka „Control Panel“ v záložce „Run Samples“
můžete sledovat základní linii = baseline. Pokud je rovná baseline, tak můžete
nastřikovat, viz postup níže. Každý vzorek nejméně 2krát. Tj. z jednoho vzorku chmele
nejméně 6 nástřiků + 4 nástřiky na kalibraci.
Přepněte se do záložky „Run Samples“ poté máte 2 možnosti:
3.
Vypište v záložce „Samples“ tyto parametry „Vial“=číslo vialky, „SampleName“
= popis vzorku, „Inj Vol“ = nastřikovaný objem (Waters Nova-Pak 10 l,
Phenomenex Gemini 2,5 l), „# of Injs“ = počet nástřiků, „Function“ = vyberte
funkci (nejčastěji se používá Inject Samples, Inject Standard, clear calibration a
equlibrate), „Method Set/Report Method“ = vyberte EBC77_1, „Run
Time(Minutes)“ = doba analýzy (40 pro kolonu Phenomenex), ostatní parametry
nepřenastavujte. Doporučuji mít v prvním řádku jen „Function“ vybrat Clear
Calibration a „Method Set/Report Method“ vybrat EBC77_1.
4.
Použít některé z předchozích stanovení a přepsat je podle aktuálních pozic v
karuselu. Klikněte na „File“ v horní liště, poté „New Sample Set“ a poté „Using
Sample Set Method“, vybrat např. ebc77_4 a stisknout tlačítko „Open“.Poté
přepište podle aktuálního stavu.
Po nastavení tabulky stiskněte tlačítko „Press to run the current sample set method“
(zkumavky s zelenou šipkou) v panelu „View Acquisition“. V následujícím okně
vyplňte „Name for this sample set“ = napište název celého setu vzorků, „Run Mode“ =
vyplňte Run and Process, „Shutdown Method“ = vyplňte shutdown_ebc, ostatní
nevyplňujte a poté stiskněte tlačítko „Run“. Naměřená data jsou v záložce „Browse
Project“ a poté v záložce „Results“. Kliknutím na příslušný nástřik se zobrazí jeho
chromatogram a po kliknutí na „View Acquisition“ i tabulka s výsledky.
Pozn.: Shutdown metoda používá cestu B, tzn. je nutné tuto cestu promýt a připravit
stejně jako v případě cesty A. Používejte jen nově připravenou čistou millipore vodu.
Průtok mobilní fáze 0,05 ml/min, Low Limit (psi) je tentokrát 0.
 Vyhřívání kolony není u této metody nutné, pracuje se při laboratorní teplotě. Pro
zvýšení přesnosti vyhřejte kolonu na 20 C. Po zapnutí vyberte funkci „MAN.“,
vyťukejte 20 a stiskněte „ENTER“. Po práci vyhřívání vypněte (kolíbka vzadu).
 Výsledky lze získat buď přímo pomocí software Empower nebo jednoduchým
výpočtem z vytištěných chromatogramů.
Výpočty:
Ci 
DF  ms  Cic  Ai
ms  Aic
Ci = koncentrace složky i (např. kohumulonu) ve vzorku vyjádřená jako % hm.
DF = ředící faktor, 1 pro extrakty, 2 pro chmel a granule
mcs = navážka kalibračního extraktu v g
Cic = koncentrace složky i v kalibračním standardu vyjádřená jako % hm.
Ai = plocha píku složky i v analyzovaném vzorku (průměr ze tří ploch)
ms = navážka vzorku
Aic = plocha píku složky i v analyzovaném standardu (průměr ze 4 ploch)
Obsah -kyselin je součtem % hm. kohumulonu a a dvojpíku humulonu a adhumulonu.
Obsah -kyselin je součtem % hm. kolupulonu a dvojpíku lupulonu a adlupulonu.
C = Ccoh + Cn+adh
C = Ccol + Cn+adl
Výsledky se vyjadřují jako % hm. na jedno desetinné místo.
Literatura: Analytica-EBC, Method 7.7, European Brewery Convention, Zoeterwoude 2005.
6.5
Stanovení volných aminokyselin piva metodou
Princip stanovení:
Aminokyseliny jsou před vlastním stanovením formou předkolonové nebo postkolonové
derivatizace převedeny na vhodný derivát, dostatečně stabilní a neintegrující s nosičem.
Metoda AccQTag využívá AccQTag fluorescenčního činidla, převádějícího primární a
sekundární aminokyseliny na stabilní fluorescenční deriváty. Následuje detekce
fluorescenčním nebo PDA detektorem.
Waters Alliance HPLC systém, se separačním modulem 2695. Součástí systému jsou dvě
nezávisle řízené pumpy v sériovém uspořádání se zpětnými ventily k izokratickým a
gradientovým operacím, autosampler, dávkovací injekční stříkačky o objemu 25, 250 a 2 500
l, dávkovací smyčky, disketová jednotka. Režim externího řízení
chromatografickým programem Empower.
Pracovní režim:
Derivatizační činidlo:
Standard:
Kolona:
Rozměr kolony:
Temperace kolony:
Detektor:
Eluenty:
Gradient:
Nástřik na kolonu:
Vnitřní standard:
Doba analýzy:
Stabilizace kolony:
Způsob vyhodnocení:
je zajištěn
Waters AccQ•Fluor Reagenční činidlo (6-aminoquinolyl-Ahydroxysuccinimidyl karbamát)
Waters Amino Acid Hydrolysate Standard
Waters AccQ•Tag Amino Acid kolona Nova-Pak C18, 4 μm
150 x 3,9 mm
37 °C
Waters Multi 2475 fluorescenční detektor s excitací 250 mm, emisí
při 395 nm
A – borátový pufr (vodný roztok)
B – acetonitril (čistota HPLC grade)
C – Milli-Q voda (18 MΩ)
Čas
(min)
počáteční
0,5
18
19
29,5
33
36
51
Průtok
(ml.min-1)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
%A
100
99
95
91
83
0
100
0
%B
0
1
5
9
17
60
0
60
%C
0
0
0
0
0
40
0
40
5 μl vzorku (koncentrace aminokyselin 5 – 200 pmolů)
kyselina α-aminomáselná
36 min
9 min na začátku, 15 min na nový vzorek
program Empower
Spektrum stanovitelných základních aminokyselin:
kyselina asparagová, serin, kyselina glutamová, glycin, histidin, arginin, threonin, alanin,
prolin, cystein, tyrosin, valin, methionin, lysin, isoleucin, leucin, phenylalanin.
Pracovní postup zahrnuje deproteinaci vzorku (metanol, vymražení), odpaření, zpětné naředění
roztokem HCl o koncentraci 0,1 mol.l-1, přídavek vnitřního standardu, derivatizaci a převedení
vzorku do vialek autosampleru.
Vyhodnocení:
Chromatografický program Empower metodou vnitřního standardu umožňuje stanovení
aminokyselin v koncentracích pikomoly.
Literatura:
Instruction Manual Waters AccQ·Tag Chemistry Package, Waters Corporation, USA, 1994
Čížková H., Hofta P., Kolouchová I., Dostálek P.: Kvasny Prum. 51, 2005, s. 47
7.
Senzorické hodnocení hotového piva
Senzorické hodnocení při kontrole jakosti
Kvalitu poživatin můžeme definovat jako shodu výrobku se standardy nebo s požadavky
spotřebitele. V souladu s touto definicí lze ke kontrole jakosti přistupovat ze dvou hledisek:
a) hledisko legislativní, podle kterého je jakost stupeň shody vlastností výrobku
s požadavky normy jakosti nebo s vlastnostmi úředně schváleného referenčního vzorku
standardu jakosti);
b) hledisko spotřebitelské (tržní hodnota), podle kterého je jakost stupeň, v kterém
výrobek splňuje požadavky spotřebitele.
Obojí přístup je velmi důležitý. Legislativní přístup chrání spotřebitele tím, že zajišťuje
prostřednictvím standardu určité minimální požadavky jakosti. Jsou zpravidla formulovány
tak, aby zajistily zdravotní nezávadnost, minimální výživovou hodnotu (např. obsah vitaminů)
a přijatelnou senzorickou jakost. těžiště kontroly je v činnosti státních a jiných správních
kontrolních orgánů.
Požadavky spotřebitelů na jakost se uplatňují hlavně tehdy, jestliže je trh nasycen
potravinářskými výrobky a existuje výběr daný jistou soutěží mezi výrobci. Poměry u nás se
postupně přizpůsobují této situace. Výrobce má pak zájem na získání spotřebitele a těžiště
činnosti při kontrole jakosti je potom v laboratořích výrobce. Různé faktory, které určují oblibu
a zájem spotřebitele, zahrnují i historické a psychosociální motivy, které ovlivňují jeho
preference.
Spotřebitelé nepožadují nutně nejvyšší jakost za každou cenu. Většinou jsou jejich nákupní
možnosti omezeny cenou výrobku a požadují proto jen jakost přiměřenou ceně a záruku, že
výrobek bude stále plnit jejich očekávání (tedy, že jeho vlastnosti nebudou znatelně kolísat).
Zájmem výrobce bude, aby se jakost jeho výrobku udržovala za daných podmínek (hlavně
cenových) na optimální úrovni.
Přístup k otázce kontroly jakosti plyne z přístupu k otázce jakosti, jak bylo definováno výše:
 Cílem kontroly jakosti z hlediska legislativního je rozhodnutí, zda výrobek odpovídá
normě či jakosti referenčního standardu nebo jim neodpovídá.
 Cílem kontroly z hlediska spotřebitelského je zjištění, v jakém stupni výrobek vyhovuje
požadavkům spotřebitele.
Pro prvý typ kontroly jakosti má základní důležitost velmi přesně a jednoznačné vymezení
hranice, pod kterou nesmí jakost klesnout. Výsledkem kontroly je závěr, že buď výrobek
standardu vyhovuje, nebo že výrobek je nestandardní.
Při druhém typu kontroly jakosti je úkolem správně a citlivě definovat stupeň jakosti a
výsledkem kontroly bude zjištění určité hodnoty - stupně jakosti. Proto každý přístup vyžaduje
jiný typ kontrolních metod, jinak zaškolené odborníky a jiné metody statistického zpracování
výsledků.
U obou přístupů ke kontrole je velmi důležitou složkou kontrola senzorické jakosti. Při určení
nestandardnosti výrobků je pochopitelně nejvýznamnější hygienická jakost a složení výrobků.
U senzorické jakosti zde bude důležité, aby výrobek neměl nějakou tak závažnou chybu, že by
znemožnila jeho požívání. Musí být také zjištěno, zda má výrobek alespoň v minimální míře
vlastnosti charakteristické pro danou poživatinu.
Při spotřebitelském přístupu ke kontrole jakosti má senzorická jakost dokonce prvořadý
význam. Spotřebitel očekává, že hygienická jakost je splněna a zkontrolována srovnáním
s normou, takže klade hlavní důraz na jemné rozdíly v senzorické jakosti a na zjištění malých
rozdílů od organoleptických vlastností, které u výrobku očekává.
Metody rozlišovací
Úkolem metod rozlišovacích (rozdílových, diskriminačních) je zjištění, zda mezi vzorky
existuje nebo neexistuje rozdíl v organoleptických vlastnostech nebo senzorické jakosti.
Nejčastěji se srovnávají dva vzorky. Pro rozdílové zkoušky potřebujeme podle našich
zkušeností nejméně 10, lépe 20 až 30 hodnotitelů. ISO doporučuje mírně odlišné hodnoty;
počet bude záležet na zjišťovaných rozdílech a na zkušenostech hodnotitelů. Rozdílové
zkoušky jednostimulové a dvoustimulové mají specifický charakter.
Rozdílové zkoušky se mohou také použít ke stanovení velikosti rozdílu na základě
Thurstoneova zákona srovnávacího posuzování, který praví, že stupeň rozlišení je tím lepší,
čím je rozdíl vlastností větší; avšak vztah není jednoduchý a výsledky různých mechanik se
nedají srovnávat. Výběr vhodné rozdílové metody záleží na úkolu a kvalitě hodnotitelů.
Párová zkouška
Nejstarší a stále hojně (pro svou jednoduchost) používanou rozdílovou metodou je zkouška
párová. Při této zkoušce hodnotitel obdrží najednou dva vzorky (A a B) v nahodilém pořadí.
Vzorky ovšem musejí být předloženy ve stejných nádobách (lišících se jen kódem), ve stejném
množství a musejí mít stejnou teplotu. Hodnotitel vzorky v předloženém pořadí ochutná
(degustaci obou vzorků smí libovolně opakovat) a rozhodne, zda rozpoznal nějaký rozdíl nebo
nerozpoznal. Výsledek se zapíše do protokolového formuláře. Někdy se úkol kombinuje: při
zjištění rozdílu se dává hodnotiteli ještě úkol, aby určil směr rozdílu (která chuť je silnější
apod.), což nepovažuji za správné (viz dále).
Určitou nevýhodou rozdílové párové zkoušky je, že nemůžeme a priori vytvořit nulovou
hypotézu. Při preferenční zkoušce se ptáme, který ze dvou vzorků je lepší; vybíráme tedy ze
dvou vzorků, takže pravděpodobnost náhodného určení správné odpovědi je P = 50 %, ovšem
velmi záleží na tom, jak se položí otázka. Když se za otázkou, zda je rozdíl, položí ještě úkol,
aby v případě zjištěného rozdílu se hodnotitel vyjádřil k velikosti tohoto rozdílu, pak ihned
pravděpodobnost zjištění rozdílu (byly podány identické vzorky) stoupla na P = 65 %.
U párové rozdílové zkoušky je tedy pravděpodobnost 50 %, že se ke správnému výsledku
dojde náhodou, protože jsou dvě stejně pravděpodobné možnosti odpovědi (empiricky).
Zkouška je jednosměrná. K dosažení průkazných závěrů je proto obvykle nutný větší počet
odpovědí (n = 20 až 60, i více; v praxi se často musíme spokojit i s nižším počtem odpovědí).
Průkaznost u rozdílových zkoušek volíme obyčejně na hladině pravděpodobnosti P = 99 %.
Protože je často obtížné zajistit dostatečný počet osob k hodnocení, dáváme každému
hodnotiteli několik párů vzorků k posouzení (v nahodilém pořadí vzorků).
Výsledky se statisticky vyhodnotí nejčastěji podle tabulek; v tab. 1 je uveden minimální počet
odpovědí nutný pro zamítnutí nulové hypotézy, která zní, že neexistuje rozdíl mezi vzorky.
Jestliže je z daného počtu odpovědí počet kladných odpovědí stejný nebo větší než tabelární
hodnota, předpokládáme, že rozdíl byl prokázán. Např. bylo 18 hodnotitelům předloženo po
dvou párech piva ze dvou závodů téhož podniku a úkolem bylo zjistit s pravděpodobností P =
99 %, zda jsou nerozeznatelné. Z celkového počtu 36 odpovědí 21 nezjistilo rozdíl, v 15
případech byla odpověď, že rozdíl existuje.
Podle tab. 1 je hraniční hodnota n = 27, takže byla potvrzena nulová hypotéza, že vzorky jsou
shodné a není mezi nimi znatelný rozdíl.
Jak je z popisu patrno, je párová zkouška velice jednoduchá, neklade velké nároky na paměť a
je tedy vhodná pro všechny typy hodnotitelů nezávisle na stupni zaškolení; je použitelná i pro
spotřebitelské zkoušky. Nevýhodou je nutnost značného množství vzorku i hodnotitelského
času.
Tabulka 1
Vyhodnocení průkaznosti u párové rozdílové zkoušky a zkoušky duo-trio
POČET
PODANÝCH PÁRŮ
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
MINIMÁLNÍ POČET
SHODNÝCH ODPOVĚDÍ NEZBYTNÝCH PRO PRŮKAZ
PLATNOSTI ROZDÍLU NA HLADINĚ PRAVDĚPODOBNOSTI
P = 95 %
P = 99 %
P = 99,9 %
7
8
8
8
9
9
10
10
11
11
10
11
12
11
12
13
12
13
14
12
13
14
13
14
15
13
15
16
14
15
17
15
16
17
15
17
18
16
17
19
17
18
19
17
19
20
18
19
21
18
20
21
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
60
70
80
90
100
19
20
20
21
21
22
23
23
24
24
25
25
26
27
27
28
28
29
29
30
31
31
32
32
33
39
44
50
55
61
20
21
22
22
23
24
24
25
25
26
27
27
28
28
29
30
30
31
31
32
33
33
34
34
35
41
47
52
58
64
22
23
23
24
25
25
26
27
27
28
29
29
30
31
31
32
32
33
34
34
35
36
36
37
37
44
50
56
61
67
Zkouška duo-trio
Výhody a nevýhody párové zkoušky platí snad ještě ve větší míře i pro zkoušku duo-trio. Jak
název zkoušky naznačuje, podávají se celkem tři vzorky, z toho dva neznámé. První vzorek je
referenční, podávaný neanonymně jako standard. Další dva vzorky jsou zakódované a mají být
s referenčním vzorkem srovnány. Z těchto dvou neznámých vzorků je jeden opět stejný jako
vzorek referenční, ale tentokrát podávaný anonymně. Druhý neznámý vzorek je vzorek
zkoumaný. Jejich pořadí v řadě je nahodilé. Hodnotitel nejprve ohodnotí referenční vzorek
(standard) a pak oba neznámé vzorky; posouzení standardu i libovolného neznámého vzorku
může podle potřeby opakovat. Potom rozhodne, který ze srovnávaných vzorků je shodný
s referenčním a který je odlišný.
Podobně jako u párové zkoušky jsou i zde dvě možnosti volby a zkouška je jednosměrná.
Výsledky je proto možné vyhodnotit také podle tab. 1 jako výsledky párové zkoušky. Např.
bylo 15 hodnotilelům předloženo po 2 sadách ovocných moštů ze dvou odrůd jablek. Sledovali
charakter chuti; z 30 odpovědí bylo 19 správných a 11 nesprávných; podle tab.1 je hraniční
hodnota (při hladině pravděpodobnosti P = 99 %) 23 správných odpovědí. Protože 19<23,
nulová hypotéza se nezamítá a rozdíl mezi vzorky je neprůkazný. Při jiném pokusu bylo 20
hodnotitelům podáno po 4 sadách vzorků mléka rekonstituovaného ze sušeného mléka ze dvou
různých provozních linek, s úkolem sledovat rozdíly v chutnosti. Z 80 odpovědí bylo 61
správných a 19 nesprávných. Podle tab.1 je při hladině pravděpodobnosti P = 99 % hraniční
počet 52 správných odpovědí. Protože 61>52, je nutno zamítnout nulovou hypotézu, že mezi
vzorky není rozdíl. Sušené mléko vyrobené na jedné lince se tedy liší od sušeného mléka
vyrobeného na druhé lince.
Na rozdíl od párové zkoušky má u zkoušky duo-trio hodnotitel k dispozici známý referenční
vzorek, takže snadněji zjistí existenci rozdílu. metoda je proto vhodná pro určení malých
rozdílů mezi zkoumaným a referenčním vzorkem. latí to zvláště tehdy, jestliže hodnotitelé
znají referenční vzorek již z dřívějších zkoušek (je to např. běžný produkt podniku). Zkouška
je vhodná i pro méně zkušené hodnotitele, takže se hodí např. i pro zaškolování. Další výhodou
proti párové zkoušce je, že není třeba přesně definovat při zadání úkolu sledovanou vlastnosti.
Počet potřebných odpovědí je asi jako u párové zkoušky, někdy i menší, ale celkový počet
potřebných vzorků je větší o podávané standardy.
Trojúhelníková zkouška
jinou starší,l ale stále hojně používanou metodou, je zkouška trojúhelníková. Podstata této
zkoušky spočívá v tom, že hodnotitel obdrží k posouzení řadu tří vzorků. Dříve se vzorky
podávaly uspořádané ve formě trojúhelníku, kdežto dnes se obvykle podávají v řadě.
Trojúhelníkové uspořádání totiž může podporovat v hodnotiteli domněnku, že základnu tvoří
dva identické vzorky a protilehlý vrchol vzorek odlišný.
V řadě tří vzorků jsou vždy dva vzorky stejné a jeden vzorek odlišný, takže je možných 6
kombinací: ABB BAB BBA BAA ABA AAB. Tyto kombinace se podávají tak, aby byly
v celém souboru zastoupeny stejně často nebo zcela nahodile.
Hodnotitel postupně ochutná vzorky v předloženém pořadí a pokud si přeje, může ochutnání
libovolně opakovat. je chybou, jestliže se vzorky ochutnávají v rychlém sledu, protože pak
jejich vlastnosti splývají. Doporučuje se proto, aby si hodnotitel po každém ochutnání vypláchl
ústa a počkal 30 až 60 sekund před ochutnáním dalšího vzorku. Potom rozhodne, které dva
vzorky jsou stejné a který je odlišný a výsledek zaznamená do protokolového formuláře.
Doporučujeme, aby byl hodnotitel nucen rozhodnout, i když nepozoruje žádné rozdíly (nucená
volba). U trojúhelníkové zkoušky může být kterýkoli ze tří vzorků odlišný, takže jsou tři
možnosti odpovědi a s pravděpodobností P = 33,3 % lze ke správnému výsledku dojít náhodou.
Zkouška je jednostranná. Ve srovnání s předcházejícími zkouškami je tedy menší
pravděpodobnost náhodné správné odpovědi a stačí proto menší počet odpovědí (obvykle již
30 nebo méně) k bezpečným závěrům. Pokud předpokládáme stejný počet ode všech
kombinací, pak počet odpovědí musí být dělitelný šesti.
Výsledky se vyhodnotí pomocí tabulky 2, kde jsou uvedeny hraniční počty správných
odpovědí. např. 30 posuzovatelům bylo předloženo po jedné sadě pomerančových džusů A a
B, z nichž vzorek A byl skladován 6 měsíců při teplotě 18 až 22 °C a vzorek B při teplotě
15 °C. Z 30 odpovědí bylo 17 správných a 13 nesprávných. Pro hladinu pravděpodobnosti P =
99 % z tab. 2 plyne, že minimální počet správných odpovědí nezbytný pro zamítnutí nulové
hypotézy je právě 17. Znamená to, že byl prokázán rozdíl mezi vzorky.
Tabulka 2
Vyhodnocování výsledků trojúhelníkové zkoušky
CELKOVÝ POČET
ODPOVĚDÍ
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
50
60
70
80
MINIMÁLNÍ POČET
ODPOVĚDÍ NUTNÝCH PRO ZAMÍTNUTÍ
NULOVÉ HYPOTÉZY
P = 95 %
P = 99 %
P = 99,9 %
4
5
5
5
6
6
5
6
7
6
7
8
6
7
8
7
8
9
7
8
9
8
9
10
8
9
10
9
10
11
9
10
12
10
11
12
10
11
13
10
12
13
11
12
14
11
13
14
12
13
15
12
14
15
13
14
16
13
14
16
13
15
17
14
15
17
14
16
18
15
16
18
15
17
19
16
17
19
16
18
19
16
18
20
17
19
20
17
19
21
18
19
21
18
20
22
18
20
22
19
21
23
19
21
23
20
22
24
24
26
28
28
30
33
32
34
37
35
38
41
Trojúhelníková zkouška je náročnější na paměť a zkušenosti hodnotitele než obě předešlé
zkoušky, a to zvláště při hodnocení vzorků s dlouho doznívajícími vlastnostmi (jedlý olej,
čokoláda, pivo aj.), ale nezkušení hodnotitelé si ji mohou rozložit na 3 párové zkoušky (každý
vzorek s každým). Názory na výhodnost trojúhelníkové zkoušky se různí. Podle našeho názoru
je metoda dosti náročná na množství materiálu a na vynaložený čas, takže je nutné zvážit její
použití. Pro méně zkušené hodnotitele je výhodnější zkouška párová, pro velmi zkušené
naopak zkouška s menší pravděpodobností náhodného správního výsledku.
Zkouška tetrádová
Kombinací zkoušek duo-trio a trojúhelníkové vznikla zkouška tetrádová. jak již název
naznačuje, podávají se celkem 4 vzorky. První je neanonymně podávaný vzorek referenční
(standard, např. A) a pak následuje trojice neznámých vzorků. Jsou to různé kombinace
referenčního vzorku A i srovnávacího vzorku B, tentokrát podávané anonymně. Tyto
kombinace jsou vlastně stejné jako u trojúhelníkové zkoušky, takže je možných 6 kombinací:
SXXS SXSX SSXX SXSS SSXS SSSX, kde S = standard a X = srovnávací vzorek.
Hodnotitel má za úkol ochutnat nejprve vzorek předložený jako referenční a pak
v předloženém pořadí ochutnat tři neznámé vzorky (tento postup se může upravit na 3 párové
zkoušky tak, že se každý neznámý vzorek srovná se vzorkem referenčním). Ochutnávání
vzorku referenčního a neznámých vzorků smí hodnotitel libovolně opakovat. Pak rozhodne,
které neznámé vzorky (jeden nebo dva) jsou shodné se vzorkem referenčním a které (jeden
nebo dva) jsou odlišné. Výsledek zapíše do protokolového formuláře.
Tetrádová zkouška je pro hodnotitele asi stejně náročná jako trojúhelníková (která se také
může rozložit na tři párové zkoušky), ale pravděpodobnost náhodného určení správného
výsledku je jen 1 : 6 = 16.7 %; stačí tedy již malý počet odpovědí (obyčejně 10 až 20),
abychom získali průkazné závěry. Při vyhodnocování se zjistí celkový počet odpovědí a počet
správných odpovědí a v tab. 3 se vyhledá, zda nulovou hypotézu můžeme přijmout nebo
musíme zamítnout.
Tabulka 3
Vyhodnocování výsledků tetrádové zkoušky
CELKOVÝ POČET
ODPOVĚDÍ
5
6
7
8
9
10
11
12
13
MINIMÁLNÍ POČET
SPRÁVNÝCH ODPOVĚDÍ NUTNÝCH PRO ZAMÍTNUTÍ
NULOVÉ HYPOTÉZY
P = 95 %
P = 99 %
P = 99,9 %
4
4
5
4
5
6
4
5
6
5
5
6
5
6
7
5
6
7
5
6
8
6
7
8
6
7
8
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
6
7
7
7
7
8
8
8
8
9
9
9
7
8
8
8
9
9
9
9
10
10
10
10
9
9
9
10
10
10
11
11
11
12
12
12
Literatura:
Pokorný J.: Metody senzorické analýzy potravin a stanovení senzorické jakosti, Ústav
zemědělských a potravinářských informací, Praha 1993.

Návody pro laboratoře sladařství a pivovarství

Transkript

Podobné dokumenty

Cytogenetika-06-Pohlavni bunky

prenatální diagnostika

Návod k obsluze

Informační dokumenty k Mezinárodnímu programu měření

ODBOR APLIKOVANÉ EKOLOGIE Program snížení

Návod - HERON EGM 68 AVR-3

Stanovení ibuprofenu

Nařízení č. 2003/2003/ES

Vinařský obzor

Fulltext

hájek m. - Portál ÚSES - Územní systém ekologické stability

průmysl 10 - Kvasný průmysl

BOT_OBMSB_2_cast - isb

Prezentace aplikace PowerPoint

Základy histopatologických vyšetřovacích metod

Úloha č.6 - Lide na UHK

OPALOVÁNÍ BEZ SLUNCE

Úkoly 1 Teorie - Praktikum.Brejlovec.net

Amino Acid AQC - Watrex Praha sro

ROZDÍLOVÉ TESTY A JEJICH VYHODNOCOVÁNÍ