Časopis LABAG 1/2016

LABAG
NOVINKY A ZAJÍMAVOSTI Z LABORATOŘE AGEL a.s.
DIAGNOSTIKA ANÉMIE
AGEL
LABORATOŘE
str. 2-3
č. 1 2016
NOVINKY V LABORATOŘI
KLINICKÉ HEMATOLOGIE...
str. 4
VÍC NEŽ EVROPSKÝ STANDARD
CALL CENTRUM
AGEL
POLIKLINIKA
str. 7
LABAG
Vážená paní doktorko, vážený pane doktore, milé kolegyně a milí kolegové,
dostává se Vám do rukou další číslo laboratorních novin Laboratoře AGEL a.s., které je zaměřeno na
problematiku hematologie. Jedním z nejčastějších důvodů odesílání pacientů k hematologickému
vyšetření představuje nález anémie. V tomto čísle najdete stručný popis diagnostického postupu
u pacientů s anémií a zároveň Vám bude představena nová hematologická linka, která na rozdíl od běžných
analyzátorů umožňuje díky moderním technologickým způsobům vyšetření dalších nadstavbových
klinických parametrů, které mohou dále zpřesnit diagnostiku onemocnění krve. V časopise naleznete
i seznam nejčastějších laboratorních vyšetření, která jsou v hematologické praxi nedílnou součástí
diagnostických postupů. Moderní vyšetřovací metody, které nabízí naše laboratoř, a navazující úzká
spolupráce s lékaři Oddělení klinické hematologie, umožňují provádění cílené personalizované laboratorní
medicíny a zefektivnění a zkrácení doby diagnózy a následné zahájení léčby.
Děkujeme za dosavadní spolupráci a těšíme se na její pokračování v roce 2016.
MUDr. Martin Brejcha, Ph.D.
primář Oddělení klinické hematologie, Nový Jičín
DIAGNOSTIKA ANÉMIE
Anémie, neboli chudokrevnost, je charakterizována poklesem hladiny hemoglobinu pod fyziologickou mez
(120 g/l u žen a 135 g/l u mužů). Anémie je vždy projevem nějakého jiného onemocnění a při jejím nálezu je
nutné důsledné vyšetření příčiny poklesu hladiny hemoglobinu. Anémie může být způsobená krevními ztrátami,
nedostatečnou tvorbou erytrocytů nebo jejich zkráceným přežíváním. V některých případech se příčiny mohou
i navzájem kombinovat. Prvním krokem diagnostického postupu je fyzikální vyšetření s anamnézou
a laboratorní vyšetření. Následně jsou cíleně indikována další vyšetření, jako např. endoskopická vyšetření
zažívacího traktu, zobrazovací metody a vyšetření kostní dřeně. Objasnění příčiny vzniku anémie je nezbytné
ke stanovení správného léčebného postupu.
VYŠETŘOVACÍ POSTUP
Pro základní diagnostickou rozvahu je důležité zhodnocení objemu erytrocytů (MCV). Podle něj dělíme anémie
na mikrocytární, normocytární a makrocytární. Mikrocytární anémie (MCV < 80 fl) je typická pro anémii
z nedostatku železa, pro anémii chronických chorob a pro thalasémii. Makrocytární anémie (MCV > 95 fl) bývá
projevem nedostatku vitamínu B12 nebo folátu, dále se objevuje u abusu alkoholu, užívání některých léků (např.
hydroxyurea, methotrexát, 6-mercaptopurin), při hemolýze, jaterních chorobách, hypothyreóze
a myelodysplastickém syndromu. U normocytární anémie (MCV 80-95 fl) se příčiny většinou kombinují, popř.
ji prokazujeme u anémie chronických chorob nebo po akutní krevní ztrátě.
Základním diagnostickým vyšetřením je krevní obraz s mikroskopickým zhodnocením diferenciálního rozpočtu
bílých krvinek, zhodnocení počtu retikulocytů a biochemický screening (urea, kreatinin, kyselina močová, jaterní
testy). Na základě výsledků klinického vyšetření, anamnézy, krevního obrazu s diferenciálem a biochemie
indikujeme další laboratorní testy, mezi které patří vyšetření zásob železa, hladina vitamínu B12 a folátu, testy
zaměřené na hemolýzu (LDH, bilirubin, haptoglobin, Coombsův test), elektroforéza bílkovin, hormony štítné
žlázy. Další diagnostický postup se odvíjí od výsledku laboratorních vyšetření. U pacientů s průkazem
sideropenie pátráme po zdroji chronických krevních ztrát, indikujeme gastroenterologické, gynekologické nebo
urologické vyšetření. Vyšetření příčiny sideropenie musí být vždy důsledné, neboť jednou z jejích příčin mohou
být nádorová onemocnění gastrointestinálního nebo urogenitálního traktu. U pacientů s deficitem vitamínu
B12 je prováděna gastroskopie, u pacientů s hemolytickou anémií je nutné vyloučit nádorové nebo revmatické
onemocnění. Vyšetření kostní dřeně (aspirace, popř. trepanobiopsie) se provádí především u pacientů
s nevysvětlitelnou anémií, pancytopenií, leukoerytroblastovou reakcí, monoklonální gamapatií a anémií s velmi
nízkým počtem retikulocytů.
VYŠETŘENÍ ZÁSOB ŽELEZA
Deficit železa je nejčastější příčinou anémie. Diagnostika sideropenie je při vyšetření běžně dostupných
biochemických ukazatelů poměrně snadná, diagnostická úskalí nastávají v případech souběžného výskytu
sideropenie a probíhajícího zánětu. Častým projevem sideropenie je mikrocytóza erytrocytů, ta však může být
přítomná i u anémie chronických chorob, současně je u obou typů anémie sníženo sérové železo (FeS).
U sideropenické anémie je však nízká hladina železa projevem jeho snížených zásob v organizmu, u anémie
chronických chorob jsou však zásoby železa vysoké, dochází ale k poruše jeho mobilizace pro erytropoezu.
2
LABAG
Diferenciální diagnostika těchto dvou anémií je uvedena v tabulce.
K rychlé orientaci zhodnocení zásob železa slouží především zhodnocení FeS, ferritinu a solubilních
transferinových receptorů (sTfR):
· FeS nízké, ferritin nízký, sTfR zvýšené → sideropenie
· FeS nízké, ferritin zvýšený, sTfR snížené → není sideropenie
· FeS nízké, ferritin zvýšený, sTfR zvýšený → sideropenie je pravděpodobná při hladině ferritinu < 100 μg/l,
a je-li TfR-F index zvýšený. Vhodné je zhodnotit i CRP. Je-li zvýšené, může být hladina ferritinu ovlivněna
akutní zánětlivou reakcí a má tedy menší výpovědní hodnotu.
NEJČASTĚJI POUŽÍVANÉ BIOCHEMICKÉ UKAZATELE KE ZHODNOCENÍ ZÁSOB ŽELEZA
· sérové železo (FeS):
jeho snížení je nespecifickým ukazatelem, neboť snížené může být jak při sideropenii, tak anémii chronických
chorob. Izolované vyšetření sérového železa má malý význam.
· ferritin:
je nejdůležitější ukazatel zásob železa, u sideropenie je typicky snížený. Patří mezi reaktanty akutní fáze, proto
je zvýšený u onemocnění se zánětlivou reakcí. Hodnoty nad 100 ng/ml již ale prakticky vylučují sideropenii.
· transferin:
transportní bílkovina pro železo. Při sideropenii bývá zvýšený, při zánětlivé reakci naopak klesá.
· saturace transferinu:
hodnota vypočtená z hladiny železa a celkové vazebné kapacity. Snížená bývá jak u sideropenie tak anémie
chronických chorob.
· celková vazebná kapacita pro železo (CVK):
zvýšení je velmi specifické pro sideropenii, má ale malou senzitivitu.
· solubilní transferinové receptory (sTfR):
jejich zvýšení je ukazatelem poptávky tkání po železe. Jsou přímo úměrné expresi transferinových receptorů na
membránách prekurzorů červené řady a k jejich zvýšení dochází při zvýšené potřebě železa a při proliferaci
červené řady. Nejsou ovlivněny zánětlivou reakcí.
· TfR/log ferritin (TfR-F index):
představuje kombinaci výsledků vyšetření sTfR a ferritinu. Index přispívá k diagnóze sideropenie především
u nemocných, u kterých současně probíhá zánětlivá reakce, a u pacientů, u kterých je nutné odlišit zvýšení
koncentrace sTfR navozené sideropenií (TfR-F index je zvýšený) od zvýšení sTfR způsobeného hyperproliferací
erytropezy z jiného původu, např. hemolýzou, inefektivní erytropoezou apod. (TfR-F index je nízký).
Tabulka: Difereciální diagnostika sideropenie a anémie chronických chorob
Vyšetření
Sideropenie
Anémie chronických chorob
FeS
Ferritin
Transferin
Saturace transferinu
CVK
sTfR
TfR-F index
MUDr. Martin Brejcha, Ph.D.
primář Oddělení klinické hematologie, Nový Jičín
3
LABAG
NOVINKY V LABORATOŘI KLINICKÉ HEMATOLOGIE,
LABORATOŘE AGEL A.S. V NOVÉM JIČÍNĚ
Laboratoř klinické hematologie se může pochlubit novou moderní hematologickou linkou řady SYSMEX XN3000. V rámci Laboratoří AGEL a.s. došlo také ke kompletní výměně stávajících hematologických analyzátorů
ve všech satelitních laboratořích (Bílovec, Kopřivnice, Havířov, Studénka) za nové moderní analyzátory řady
SYSMEX XN, které jsou pomocí speciálního softwaru Extended-IPU navzájem propojeny s centrální laboratoří
v Novém Jičíně. Softwarový modul Extended-IPU je standardní aplikace pro správu a schvalování pracovního
procesu systémů společnosti Sysmex pro hematologická vyšetření.
Extended-IPU má pod kontrolou správu objednávek z LIS a technickou validaci výsledků. Automatizace
a optimalizace pracovních operací ve spojení s registrací každé zkumavky a kontrolou pozic zásobníků vzorků
zajišťuje snadnou sledovatelnost každé zkumavky. Takto řízený systém produkuje i méně falešně pozitivních
výsledků, protože proces technické validace je pod kontrolou vlastních hematologických pravidel Sysmexu
vycházejících z odborných zdrojů a pravidel nadefinovaných samotným zákazníkem, které vycházejí z podmínek
provozu daného zařízení. Další funkcí softwaru je online sledování primárních dat ve všech satelitních
laboratořích, jejich zpracování, archivace a v neposlední řadě i neustálá servisní podpora.
Součástí konfigurace XN-3000 jsou dva analytické moduly řady XN a velmi kvalitní plně integrovaný analyzátor
na přípravu a barvení periferních nátěrů – SP-10, součástí linky je i digitální a skenovací mikroskop DI-60.
Sysmex DI-60 je automatizovaný systém, který umožňuje detekci a analýzu buněk z pořízených digitálních
snímků. Je jediným digitálním analyzátorem na trhu, který umožňuje plné zapojení do automatického systému
laboratoře. Nevyžaduje manuální zásahy při zpracování během snímkovacího cyklu. Přístroj se skládá
z automatického mikroskopu, vysoce kvalitního digitálního fotoaparátu a IT systému, který analyzuje
a předběžně klasifikuje buňky z obarvených krevních nátěrů. Systém automaticky vyhledává buňky na snímku
a každou nalezenou buňku vyfotografuje, analyzuje a pomocí pokročilého algoritmu provede pre-klasifikaci.
Počet analyzovaných leukocytů je nastavitelný uživatelem. Možnost digitálního přenosu a vizuální informace
o dané patologické buňce, která je pořízena pomocí DI-60, posouvá hematologii jiným směrem. Tyto informace
mohou posloužit jednak k edukačním účelům a zároveň mohou umožnit aktuální konzultaci mikroskopického
nálezu v digitální podobě na dálku, tzv. telehematologie.
Nové hematologické analyzátory umožňují díky moderním technologickým způsobům analýzy vyšetření
dalších nadstavbových klinických parametrů. Hladina IPF (Frakce nezralých trombocytů) vzrůstá s rostoucí
tvorbou krevních destiček v kostní dřeni. Její měření tedy představuje vyhodnocení produkce trombocytů
v kostní dřeni na základě vzorku periferní krve. Parametr IPF má v laboratorní diagnostice a léčbě
trombocytopenie značný klinický přínos. Měření obsahu hemoglobinu v retikulocytech (RET-He) je parametr
určený pro diagnostiku a monitorování anémie z nedostatku železa. Umožňuje rychleji a s předstihem odhalit
deficit železa a změny stavu železa v erytropoéze. Dále je možné z rozložení velikosti erytrocytů (RBC) dle
histogramů rozlišit populaci mikrocytárních a makrocytárních erytrocytů procentech. Zastoupení
hypochromních a hyperchromních RBC jsou parametry analyzované v kanálu retikulocytů (RET). Odvozují se
z obsahu hemoglobinu ve všech zralých erytrocytech. Množství IG (Nezralé granulocyty) v periferní krvi
poukazuje na prvotní reakci na infekci nebo zánět. Možnost tyto buňky rychle a spolehlivě odhalit v periferní krvi
je základem pro další možnosti diagnózy a monitoringu příslušných poruch zejména na rozlišení bakteriálních
a virových infekcí v prvotních fázích infekce – rozpoznání bakteriálních infekcí novorozenců a časnou identifikaci
bakteriálních infekcí a sepse u dospělých. Toto je velmi důležité zejména v případě pacientů na jednotkách
intenzivní péče. Další z nadstavbových parametrů je Granularita neutrofilů (NEUT-SSC*). Jedná se o výzkumný
parametr získaný z měření v kanálu WDF pro diferenciální rozpočet leukocytů. Hypogranularita je příznakem
dysplazie neutrofilů, k níž obvykle dochází při myelodysplastických syndromech (MDS). Automatizovaná
detekce hypogranulárních neutrofilů má významnou diagnostickou hodnotu, pokud jde o rozlišení mezi MDS
a reaktivními a nezhoubnými idiopatickými a dědičnými příčinami neutrofilie.
Doufáme, že tato nová, moderní technologie přinese pozitivní ohlas hlavně u lékařů a pomůže při léčbě
a diagnostice nejen hematologických onemocnění.
Mgr. Michaela Kneiflová
a kolektiv Laboratoře klinické hematologie
4
LABAG
VYBRANÁ MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÁ VYŠETŘENÍ
BCR/ABL
Podle přítomnosti fúzního genu BCR/ABL (tzv. philadelphský chromozom Ph) se dělí skupina
myeloproliferativních neoplázií (MPN) na Ph-pozitivní neoplázie, kam patří chronická myeloidní leukémie
(CML), a na Ph-negativní onemocnění, do které patří polycytémie vera, primární myelofibróza, esenciální
trombocytémie a další. Přítomnost fúzního genu BCR/ABL byla prokázána asi u 95 % pacientů s diagnózou
CML, ale také u 5 % dětských a 25 % dospělých nemocných s akutní lymfatickou leukémií, kde má podstatný
prognostický význam. Fúzní gen BCR/ABL byl rovněž nalezen u malého procenta nemocných akutní myeloidní
leukémií a výjimečně byl popsán u lymfomů, mnohočetného myelomu a myelodysplastických syndromů.
JAK2 (V617F, exon 12)
Somatická mutace c.1849G>T (p.V617F) v genu JAK2 byla detekována u velké části Ph-negativních pacientů
s MPN. Mutace se vyskytuje v různě velké frakci granulocytů periferní krve u většiny pacientů s polycytémií vera
(PV, 65-97 %), u pacientů s diagnózou esenciální trombocytémie (ET) či primární myelofibrózou (PMF, 40-50 %).
Detekce mutace c.1849G>T je využívána jako diagnostický prostředek k potvrzení diagnózy PV, ET, PMF,
případně k odlišení PV od sekundární erytrocytózy a trombocytémie.
U pacientů s čistou erytrocytózou je v případě negativního výsledku při detekci mutace c.1849G>T doporučeno
pokračovat s vyšetřením mutací v exonu 12 genu JAK2.
CALR (exon 9)
Somatické mutace v exonu 9 genu CALR se nachází u JAK2-negativních pacientů s diagnózou ET (70 %) a PMF
(60-80 %). U pacientů s polycytémií vera přítomnost CALR mutace popsána nebyla. Detekce mutací v exonu 9
genu CALR je pomocným diagnostickým a prognostickým markerem.
MPL (exon 10)
Somatické mutace v exonu 10 genu MPL (především W515L, W515K, S505) se vyskytují u JAK2-negativních
pacientů s diagnózou PMF (5-10 %) a ET (1-5 %). Detekce mutací v exonu 10 genu MPL je pomocným
diagnostickým a prognostickým markerem
c-KIT (D816V)
Systémová mastocytóza je vzácné myeloproliferativní onemocnění, které vzniká patologickou kumulací
mastocytů v různých orgánech, velmi často v kůži nebo kostní dřeni. Identifikace aktivační mutace c.2447A>T
(p.D816V) v genu c-KIT v postižené tkáni ovlivňuje výběr terapie.
IgVH
Mutační status variabilní části těžkého řetězce imunoglobulinového genu IgVH (přímá nukleotidová sekvenační
analýza Ig segmentů) je významné prognostické kritérium pro rozdělení B-CLL pacientů do dvou skupin.
U jedné skupiny pacientů lze očekávat indolentní formu onemocnění, u druhé skupiny lze naopak očekávat
agresivní průběh nemoci s výrazně kratší dobou přežití.
Ig gen se, na rozdíl od ostatních genů, nedědí jako stabilní jednotka. V průběhu B-buněčné diferenciace je u
každého jedince Ig gen skládaný rekombinačním mechanizmem vždy z jednoho ze 123 variabilních (V), 27
rozlišovacích (D) a 6 spojovacích (J) subgenů, umístěných na chromozomu 14. Část seskupení tvoří funkční gen,
který dále podléhá somatickým mutacím.
Tp53
Tumor supresorový protein p53 je klíčovým regulátorem buněčného cyklu a apoptózy. Pozměněná funkce
proteinu p53, způsobená delecí chromozomu 17p a/nebo mutací v genu TP53, je spojována se špatnou
prognózou u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií (CLL). Abnormality se v genu TP53 vyskytují u 10-15
% neléčených CLL pacientů, avšak u pacientů bez léčebné odpovědi na podání fludarabinu se tato frekvence
zvyšuje až na 40 %.
CLL pacienti s mutací v genu TP53 jsou většinou rezistentní na běžně používanou chemoterapeutickou léčbu,
průběh onemocnění bývá agresivní. Mutace se mohou objevit až v průběhu onemocnění a často jsou
selektovány podanou léčbou. Analýza mutací v genu TP53 je pomocným prognostickým markerem a podle
doporučení pro diagnostiku a léčbu CLL by měla být provedena vždy před zahájením 1. linie léčby a také před
každou novou linií léčby.
5
LABAG
FV Leiden (R506Q)
Přítomnost Leidenské mutace v genu pro koagulační faktor V zvyšuje riziko vzniku žilní trombózy.
Prothrombin (G20210A)
Přítomnost mutace G20210A v genu kódující prothrombin je rizikovým faktorem pro spontánní aborty, zvláště
v prvním trimestru gravidity, a pro vznik žilní trombózy.
Přehled zápisů „trombofilních mutací“
Ĥċśetření
FV Leiden
Prothrombin (FII)
Triviální zápis
mutace
R506Q
G20120A
Systematický zápis mutace (HGVS nomenklatura)
Nukleotidový zápis (cDNA) Proteinový zápis
c.1691G>A
c.20120G>A
p.Arg506Gln
-
VYBRANÁ HEMATOLOGICKÁ VYŠETŘENÍ
Krevní obraz, diferenciál
Krevní obraz, krevní obraz s diferenciálem, mikroskopické hodnocení difer. rozpočtu leukocytů
Diferenciální rozpočet nátěru periferní krve nebo kostní dřeně – mikroskop
Barvení na železo (Perlsova reakce)
Sedimentace erytrocytů
Koagulace
KOAGULACE
Agregace trombocytů po stimulaci kolagenem
Agregace trombocytů po stimulaci ristocetinem
Agregace trombocytů po stimulaci ADP
Agregace trombocytů po stimulaci kys.
arachidonovou
Samovolná agregace trombocytů
Faktor I (Fibrinogen)
Faktor II (Protrombin)
Faktor V (Proakcelerin)
Faktor VII (Prokonvertin)
Faktor VIII (Antihemofilický faktor A)
Faktor IX (Christmas faktor)
Faktor X (Stuart-Prower faktor)
Faktor XI (Rosenthalův faktor)
Faktor XII (Hagemanův faktor)
Faktor von Willebrand - antigen
Faktor von Willebrandova – funkční aktivita
Průkaz specifického inhibitoru
Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT)
Protrombinový test (Quick)
Trombinový čas
anti Xa - LMWH
Heparinem indukovaná trombocytopenie
D-dimery
Fibrin/fibrinogen degradační produkty (FDP)
Antitrombin
Protein C
Volný Protein S
APC rezistence
ProC Global
Plazminogen
PFA 100 (Platelet Function Analyzer)
aPTT – LA (diagnostika lupus antikoagulans)
aPTT – Actin (diagnostika lupus antikoagulans)
dRVVT - diagnostika lupus antikoagulans - LA
dRVVT - diagnostika lupus antikoagulans - LA
Směsné testy (diagnostika lupus antikoagulans)
Hexagonální test (diagnostika lupus antikoagulans)
Hemoclot trombin inhibitors (PRADAXA)
Rivaroxaban (XARELTO)
6
LABAG
IMUNOHEMATOLOGICKÁ VYŠETŘENÍ
VYBRANÁ BIOCHEMICKÁ VYŠETŘENÍ
Krevní skupina
Krevní podskupina
RhD + Kell fenotyp
Screening protilátek
Screening chladových protilátek
Přímý antiglobulinový test (přímý Coombs)
Nepřímý antiglobulinový test (nepřímý Coombs)
Upřesnění senzibilizace erytrocytů
Vyšetření kompatibility transfuzního přípravku
obsahujícího erytrocyty
Albumin
Bence Jones - U
Beta2-mikroglobulin
Bilirubin-celkový
Bilirubin-konjugovaný
Celková bílkovina
Celková vazebná kapacita železa (CVK Fe)
Elektroforéza proteinů
Ferritin
Haptoglobin
Hemoglobin ve stolici
Imunoglobuliny, volné řetězce
Kyselina listová
Laktátdehydrogenáza
Okultní krvácení
S-transferinový receptor
Transferin
ymidinkináza
Vitamin B6 - pyridoxin
Vitamin B12
Železo sérové (FeS)
CALL CENTRUM LABORATOŘÍ AGEL
V rámci zkvalitňování námi poskytovaných laboratorních služeb jsme pro naše klienty zřídili CALL CENTRUM. Toto
pracoviště poskytuje spolupracujícím lékařům informace o výsledcích provedených vyšetření a přijímá požadavky
na dovyšetření. Pro zajištění maximální ochrany osobních údajů obdrží lékaři a sestry od naší laboratoře informační
kartičku s PIN kódem, sloužícím k autorizaci osoby, která bude požadovat informace o výsledcích.
Rovněž je na CALL CENTRU možno provést objednávku odběrového materiálu a získat informace o paletě
prováděných vyšetření.
Telefonní linky:
800 700 701
(výsledky vyšetření)
800 255 355
(dotazy a připomínky)
E-mail: [email protected]
1234
7
LABAG
KONFERENCE A SEMINÁŘE
Duben:
26. 4. 2016: Cesty k hemodialýze – ledviny a jejich onemocnění (seminář) - EDUCA, Nový Jičín
Květen:
11. - 12. 5. 2016: celostátní konference ČSGLS (určená středoškolským a vysokoškolským
pracovníkům ve zdravotnictví) - EDUCA, Nový Jičín
Mikrobiologická diagnostika mozkomíšního moku (seminář) - Ostrava - Vítkovice
Červen:
21. 6. 2016: Neurologie–etiologie muskulárních, neuromuskulárních a neurodegenerativních
onemocnění. Farmakologie, farmakogenetika, farmakogenomika (seminář) - EDUCA, Nový Jičín
Září:
15. 9. 2016: Laboratoře AGEL v roce 2016 – (konference) - Beskydské divadlo, Nový Jičín
Termíny vzdělávacích akcí jsou orientační. Podrobnosti ke všem seminářům a konferencím
získáte na tel. č. 724 977 890 u paní Bc. Marty Hýnarová
AGEL
LABORATOŘE
Laboratoře AGEL a.s.
Revoluční 2214/35 • 741 01 Nový Jičín • Tel.: +420 556 416 164 • [email protected] • www.laboratore.agel.cz
Redakční rada: Ing. Arpád Boday • RNDr. Lenka Kulíšková • RNDr. Jana Pospíšilová Ph.D. • Mgr. Spiros Tavandzis