Imunoreakce se značenými protilátkami

Imunoreakce se
značenými
protilátkami
Kvantitativní stanovení antigenu/protilátky:
precipitace - 30 g/ml
aglutinace - 1 g/ml
Neprecipitační imunochemické metody:
RIA, FIA, EIA - 1 pg/ml
Rozdělení metod podle použitého značení
•
•
•
•
Radioaktivní
Enzymatické
Fluorescenční
Luminiscenční
Typy imunoreakcí

Kompetitivní:
neznačený analyt v testovaném vzorku soutěží o vazebná místa
protilátek s přidaným značeným analytem
Neznačený antigen blokuje vazbu značeného antigenu – čím méně
signálu je naměřeno, tím vyšší koncentrace analytu (nepřímá
úměra).
Protilátka není v nadbytku, je přidáváno omezené množství, tak aby
mohlo docházet ke kompetici
Typy imunoreakcí

Nekompetitivní (sendvičová analýza)




Obecně nejvyšší úroveň sensitivity a specifity
Sendvič: analyt je vázán mezi dvěma specifickými protilátkami
Protilátka je v nadbytku, takže všechen analyt je vyvázán
Množství navázané značené protilátky je úměrné množství
analytu ve vzorku
Homogenní vs heterogenní metody
a) heterogenní - vyžadují separaci volné a vázané frakce analytu
b) homogenní - nevyžadují separaci volné a vázané frakce analytu




Pokud navázání protilátky na antigen ovlivní intenzitu signálu
značky (např. prostorovým blokováním, aktivního místa enzymu
protilátkou), není důvod k separaci frakcí
Homogenní metody jsou obecně používány při měření malých
analytů (léky, drogy).
Není vyžadováno oddělení komplexů Ab-Ag od volného Ag* rychlejší a jednodušší v provedení
S enzymem se ale podařilo sestavit homogenní imunoanalýzu
pouze pro několik dvojic hapten-enzym
Heterogenní imunoanalýza
Metodu heterogenní imunoanalýzy lze
sestrojit pro každou dvojici protilátkaantigen
 Stěžejní problém je separace volné a
vázané frakce: chromatograficky,
srážením imunokomplexů, nebo
zakotvením neznačeného imunoreaktantu
na pevnou fázi

Výsledky imunoanalýzy

kvalitativní
 Jediný kalibrační bod („cutoff“ bod)
 Výsledky jsou buď ‘pozitivní’ nebo
‘negativní’; (tj. nad nebo pod hodnotou
cutoff)
 Možné falešně pozitivní výsledky;
použití monoklonálních protilátek toto
nebezpečí omezuje

kvantitativní
 Vztah mezi naměřenou hodnotou a
koncentrací zkoumané látky určen z
kalibrační křivky (obvykle 5 – 6 bodů)
 Problémy může způsobovat crossreaktivitita (protilátka se váže i na jiné
podobné antigeny).
Radioimunoanalýza (RIA)

v roce 1960 (Berson a Yalow) - metoda pro stanovení koncentrace
inzulinu v plazmě

První případ, kdy bylo možné stanovit hormonální hladinu z krve
pomocí in vitro metody.

Využíváno v klinické praxi v mnoha oblastech:
 Endokrinologie (hladiny hormonů) v krvi
 digitoxin nebo digoxin u pacientů, kteří berou tyto léky
 Toxikologie: průkaz přítomnosti drog
 Krevní transfuze: přítomnost povrchového antigenu hepatitidy B
HBsAg) v darované krvi
 Imunologie: anti-DNA protilátky u systémového lupus
erythematosus (SLE).
RIA
velmi citlivá metoda
kompetitivní heterogenní metoda
postup:
Ab + Ag + Ag* v jedné směsi
separace imunokomplexů
měření aktivity, nepřímo úměrná množství Ag
Různé techniky separace imunokomplexů
• solid phase radioimmunoassay
• sekundární precipitační protilátky
• elektroforéza
• ionexová chromatografie
• precipitace přidáním solí
• varianta se značenou protilátkou - IRMA
RIA



Značení - 125I a 131I pro proteinové antigeny, tritium nebo 14C pro
nízkomolekulární látky.
Radioaktivita se měří např. scintilací.
Pro kvantifikaci nutná standardizace.
RIA
Dva způsoby provedení
1. Smísí se Ag* (známá konc.) a Ag (neznámá konc.) a směs se
inkubuje se specifickou protilátkou (volně v roztoku).
Následuje přídavek sekundární protilátky, komplex AbAg/Ag* je takto precipitován, separován, v precipitátu se měří
radioaktivita.
Primární protilátka může být imobilizována,
např. na stěně zkumavky, pak se zkumavka po přídavku směsi a
inkubaci pouze vymyje.
2. Protilátka reaguje nejdříve pouze se značeným antigenem a
přídavky neznačeného antigenu o různé koncentraci různě
vytěsňují Ag* z vazby. Ab-Ag* se tak doplňuje Ab-Ag.
Provedení RIA – 1. způsob
Separace Ab-Ag komplexu pomocí sekundární protilátky – sraženina se
separuje centrifugací
Imunoradiometrické stanovení
(IRMA)

Nekompetitivní metoda

Použití dvou protilátek – jedna značená
(125I), druhá neznačená

Neznačená protilátka imobilizována na
stěně zkumavky

Veškerý stanovovaný antigen se vyváže na
stěnu zkumavky

Promytí zkumavek

Volná značená protilátka/antigen zůstává v
roztoku a je odmyta

Měření radioaktivity ve zkumavce
př. stanovení parathormonu, C-peptidu

Nevýhody RIA
•
Náročnost a riziko spojené s prací s
radioaktivním materiálem
•
125I
•
Lidské tělo má tendenci
koncentrovat atomy jódu
(radioaktivní i neradioaktivní) ve
štítné žláze
or 131I emitují gamma záření,
které vyžaduje speciální zařízení
Gamma Counter
Enzymová Immunoassay (EIA)


Značení antigenu/protilátky enzymem
detekce: podle povahy substrátu (spektrofotometrie)

Klasifikace:
 Heterogenní nebo homogenní
 Kompetitivní nebo nekompetitivní

výhoda: Srovnatelná citlivost s RIA
výhoda: Odpadá práce s radioaktivitou
nevýhoda: nebezpečí inhibice enzymu některými látkami
v biologickém materiálu (např. salicyláty)


Enzymatická detekce
Používané substráty pro křenovou peroxidázu (horseradish
peroxidase HRP) v Ab-konjugátech:
Oxidace substrátu za přítomnosti peroxidu vodíku
Chromogenní substráty ( barevný produkt - kolorimetrická detekce)
3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin (TMB)
2,2´-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát) - ABTS
o-fenylendiamin
o-dianisidin
o-toluidin
Používané substráty pro alkalickou fosfatasu (AP) v Ab konjugátech:
4-nitrofenylfosfát
LIA (Luminiscence Immunoassay)
Chemiluminiscenční substráty (záblesky světla - detekce světla)
SuperSignal
ECL
Heterogenní enzymová assay – ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay)

Nejběžnější imunoanalýza v biochemických a klinických laboratořích

Komplex Ab-Ag je imobilizován na pevný povrch – plastové
mikrotitrační destičky

Stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek

přímá úměra mezi koncentrací analytu a aktivitou enzymu
Varianty:
 přímá ELISA
 nepřímá ELISA
 Kompetitivní ELISA
 Sendvičová ELISA
Nepřímá (nekompetitivní) ELISA





Immobilizovaný antigen.
Nejdříve se Ag inkubuje s primární
protilátkou a její nadbytek se
vymyje.
Sekundární protilátka konjugát se váže na primární Ab,
nadbytek se opět vymyje.
Pozitivní reakce - ve vzorku musí být
přítomna primární Ab.
Podmínkou spolehlivosti je, že
sekundární Ab neváže imobilizovaný
Ag ani nepřilne na stěny
mikrotitrační destičky.
Enzyme-linked immunosorbent
assay
Principle of ELISA/RIA
(ELISA)
1
3
2
4
1. Potažení jamek
antigenem
2. Přidání vzorku séra
3. Přídání enzymem
značené protilátky
(anti-human IgG)
4. Přidání substrátu
5. Odečtení barevné
reakce
Sendvičová ELISA („capture“,
„sandwich“ ELISA)
Varianta se záchytem antigenu.






Protilátka vážící Ag je immobilizována
(může to být i test jejího titru).
Přídavek Ag, promytí.
Přidá se značená protilátka, která
váže zachycený Ag.
Přísné podmínky – značená Ab
nesmí reagovat s immobilizovanou
Ab.
Značená Ab by měla být z jiného
obratlovce (králík - koza) a reaguje s
jiným epitopem
Nesmí být nespecifická vazba s
pevnou fází.
Sendvičová ELISA („capture“, „sandwich“
ELISA)
Varianta se záchytem protilátky.
 Immobilizovaná protilátka váže
protilátky ze vzorku (např. lidské IgG,
IgA nebo IgM ze zkoumaného séra
pacientů).

Po vymytí se přidá specifický antigen
a nakonec anti-Ag konjugát
poskytující signál.

Značená Ab nesmí reagovat s Ab ve
vzorku bez přítomnosti Ag.

Nesmí ani vytvářet nespecifickou
vazbu s pevnou fází
ELISA - detekce
Při sendvičové ELISE může být použito i sekundární protilátky
Kompetitivní ELISA
U kompetitivní ELISy se zkoumané
sérum inkubuje společně se
značeným anti-Ag konjugátem.
Antigen je vázán na nosič.
Kompetice o vazbu protilátky
Nutná standardizace.
Kompetitivní ELISA – varianta s
immobilizovanou protilátkou

Detekce antigenu v séru

Nespecifické vazby
protilátek mohou být
odstraněny blokováním
stěn ELISA destiček 0.1%
roztokem BSA.
EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)
homogenní EIA
antigen je navázán na enzym
lyzozym
malátdehydrogenáza,
glukóza-6-fosfátdehydrogenáza
protilátky kompetují o antigeny
po vzniku imunokomplexu dochází
k měřitelné změně aktivity enzymu
• snížení – obvyklé, blokáda vazebného místa, konf. změna
• zvýšení – jen tyroxin, konformační změna
použití – stanovení koncentrace nízkomolekulárních látek
(haptenů - léků a drog v tělních tekutinách)
• léky – antibiotika, cytostatika, digoxin
Kompetitivní
• hormony – T3, T4, kortizol
Homogenní
Čím více antigenu tím více signálu
Avidin-biotin systém
Zesilovací efekt: Avidin je glykoprotein (MW 68 Kd), který má vysokou afinitu
k malé molekule (MW 24Kd) vitaminu biotinu, rozpustnému ve vodě.
Biotin může být konjugován k celé řadě biomolekul, včetně protilátek, a to tak,
že k jedné molekule protilátky může být připojeno mnoho molekul biotinu.
Biotinylovaná protilátka potom může vázat několik molekul avidinu.
Podobné vlastnosti jako avidin má také streptavidin (MW 60 Kd),
izolovaný z bakterie Streptomyces avidinii .
Využití ELISA metod


výzkum
humánní a veterinární diagnostika
Příklady :
 Screening dárců krve na virové infekce
 HIV-1 and HIV-2 (přítomnost anti-HIV protilátek)
 hepatitis C (přítomnost protilátek)
 hepatitis B (testování protilátek, antigenů)
Využití ELISA metod


Hormonální hladiny
 HCG (test těhotenství)
 LH (určení ovluace)
 TSH, T3 and T4 (funkce štítné žlázy)
 hormony (e.g., anabolika, HGH) u sportovců
Detekce infekcí
 Sexuálně přenosné (HIV, syphilis, and chlamydia)
 hepatitis B and C
 Toxoplasma gondii
Využití ELISA metod




Detekce alergenů v jídle a prachu
Stanovení revmatoidního faktoru, autoprotilátek u autoimunitních
onemocnění (lupus erythematosus)
Měření toxinů v kontaminovaném jídle
Detekce drog
 kokain
 opiáty
 Δ-9-tetrahydrocannabinol
FIA (Fluoro Immuno Assay)









metody využívají toho, že některé látky po ozáření absorbují
energii a se zpožděním jí část vyzáří
Stokesův posun = rozdíl mezi vlnovou
délkou pohlceného a vyzářeného záření
heterogenní i homogenní uspořádání
kompetitivní i nekompetitivní techniky (obdoba EIA)
měření fluorescence je silně ovlivňováno prostředím (interference
některých látek v séru, fluorescence trvá řádově nanosekundy)
citlivější než měření radioaktivity
stanovení nízko- i vysokomolekulárních látek
značka: konjugovaný nebo kovalentně vázaný fluorochrom
fluorescein-isothiokyanát (FITC)
umbeliferon
cheláty vzácných zemin (Eu, Tb, Sm)
detekce: fluorometricky
Princip fluorimetru


Základní konstrukce fluorimetrů sestává ze zdroje zářivé energie,
dvou optických separačních prvků a detektoru.
Zdrojem záření jsou nejčastěji halogenové žárovky a xenonové
výbojky. Světlo ze zdroje prochází buď interferenčním filtrem nebo
mřížkovým monochromátorem. Dále prochází kyvetou s roztokem
měřeného vzorku a emitovaná fluorescence se měří pod úhlem
90 °, kdy po průchodu filtrem nebo po difrakci reflexní mřížkou
dopadá emitované světlo vybrané vlnové délky na fotonásobič.
Fluorimetr obsahuje také pomocné optické prvky jako clonku, čočky a zrcadla;
špičkový přístroj má navíc dělič paprsku přivádějící část světla k referenčnímu
fotonásobiči.
Heterogenní FIA
SepFIA = Separační FIA
• značený antigen
IFMA = ImmunoFluoroMetric Assay
• značené protilátky
MEIA = Microparticle Enzyme IA
• mikročástice s protilátkou, na které se váže Ag
• druhá protilátka s alkalickou fosfatázou
• po separaci se přidá substrát a fosfatáza štěpí substrát
(4-metylumbelliferylfosfát) na produkt s vyšší
fluorescencí
Homogenní FIA
jednoduché uspořádání je málo citlivé a
použitelné jen na hapteny
 modifikace zvyšují přesnost i citlivost
DELFIA
FPIA

Fluorescent Polarized Immunoassay (FPIA)





homogenní, kompetitivní, značený
Ag
rovinně polarizované excitační
záření
malé molekuly v roztoku rychle
rotují
depolarizace záření
po vazbě Ag* na protilátku se
rotace zpomalí
emitované
fluorescenční záření zůstává
polarizováno (polarizační filtry)
stanovení malých molekul (např.
nádorové markery, hormony, léky,
vitamíny)
nepřímá úměra mezi koncentrací analytu a
naměřenou fluorescencí
LIA (CLIA) ChemiLumminiscence
ImmunoAssay

Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních jevů tím, že
excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po
nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se k aktivaci činidel využívá
oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence).
luminiscenční značka – chemiluminofor
luminol, izoluminol (aktivace přidáním H2O2)
luciferáza - luciferin
citlivost je vyšší než u RIA
modifikace:
 luminiscence zesílená enzymem (enzym AP)
 elektroluminiscence (ECLIA)