Z-ANO - České vysoké učení technické v Praze

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ
Katedra biomedicínské techniky
TÝMOVÝ PROJEKT
2011/2012
Ondřej Skopal
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE
Fakulta biomedicínského inženýrství
Katedra biomedicínské techniky
Použití metod světelné mikroskopie k detekci
mikroorganizmů v mikrobiologii
Týmový projekt
Vedoucí projektu: Mgr. Veronika Vymětalová
Student:
Ondřej Skopal
leden 2012
Anotace
Cílem mé části týmového projektu bylo představení nejdůležitějších rodů
probiotických mikroorganismů, jejich stručný popis a charakteristika jejich účinků na
lidský organismus. V praktické části bylo poté záměrem ověřit možnosti využití
světelné mikroskopie při pozorování těchto mikroorganismů.
Abstract
The objective of my part of the team project was to introduce the most important
genera of probiotic microorganisms, their brief descriprion and characterisation of
their effect on human health. In the practical part I wanted to prove the use of a light
microscopy
methods
for
observing
these
microorganisms.
Poděkování
V první řadě bych rád poděkoval vedoucí týmového projektu, paní Mgr. Veronice
Vymětalové, za to, že nám byla po celou dobu práce na týmovém projektu
nápomocna a důsledně nás vedla k jeho zdárnému dokončení. Rád bych také
poděkoval celému týmu, jmenovitě Martinu Šišmovi a Monice Burdové, za vzornou
spolupráci a pomoc především při vypracovávání praktické části.
II
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem týmový projekt s názvem „Použití metod světelné mikroskopie k
detekci mikroorganizmů v mikrobiologii“ vypracoval samostatně a použil k tomu úplný
výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k závěrečné
zprávě.
Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona
č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o
změně některých zákonů (autorský zákon).
V ……………. dne ………………
…..……………….
Podpis
III
Obsah
1. Úvod ……………………………………………………………………………..….str 1
2. Současný stav řešené problematiky…………………………………..……….…...str. 2
2.1 Probiotika ………………………………………..……...………………….. str. 2
2.2 Prokaryotní probiotika …………………..…………..………………..….…str. 4
2.2.1 Bacillus ………………..………………………..………………... str. 4
2.2.2 Bifidobakteria …….…………………………..….……...……….. str. 7
2.2.3 Lactobacillus ………..……………………..…………………….. str. 9
2.2.4 Lactobacillus acidophilus ………………..……………………. str. 12
2.2.5 Streptococcus thermophilus ……..…………………………… str. 13
2.2.6 Enterococcus faecium …………..…………………………….. str. 14
2.3 Eukaryotní probiotika …………………………………….….…………....str. 16
2.3.1 Saccharomyces boulardii …………………..…………………. str. 16
2.3.2 Saccharomyces cerevisiae …………..……………………….. str. 17
3. Světelné mikroskopické techniky používané pro pozorování mikroorganismů
……… ………………………………………………………………………………...str. 20
4. Experimentální část ……………………………………………………..…….……str. 22
5. Závěr ……………………………………………………………………………….. str. 24
6. Literatura ……………………………………………………………………….……str. 25
IV
Seznam vyobrazení
Obr. 1: Bacillus subtilis a využtí různých barviv (A-crystal violet, B-methylene blue,
C- carbol fuschin) při jeho pozorování světelným mikroskopem
Zdroj: http://www.currentprotocols.com/protocol/mca03e
……………………………………………………………………………………… 12
Obr. 2: Sporulační životní cyklus
Zdroj: Obrázek upraven podle Cutting, Simon M., 2010 [1]
……………………………………………………………………………………… 14
Obr. 3: Bifidobacteria pod světelným mikroskopem
Zdroj: http://www.under-microscope.com/lifeforms/bacteria/bifidobacterium/
……………………………………………………………………………………… 15
Obr. 4: Lactobacillus rhamnosus GG pod světelným mikroskopem
Zdroj:http://www.sciencecodex.com/read/probiotic_protects_intestine_from_ra
diation_inj
ury-81692
……………………………………………………………………………………… 17
Obr. 5: Lactobacillus acidophilus pod světelným mikroskopem
Zdroj: http://www.dairyscience.info/probiotics/110-whey-probiotics.html?start=5
……………………………………………………………………………………… 20
Obr. 6: Enterococcus faecalis pod světelným mikroskopem
Zdroj:http://biomarker.cdc.go.kr/biomarker/pathogen/pathogen_view_en.jsp?p
class=1&id= 60
……………………………………………………………………………………... 22
Obr. 7: Saccharomyces cerevisiae při 1000 násobném zvětšen
Zdroj: http://www.uwyo.edu/virtual_edge/lab13/fungi_results.htm
…………………………………………………………………………………….. 25
V
1. Úvod
Mikroorganismy jsou všudypřítomné a ať chceme či nechceme, přímo či nepřímo se
s nimi setkáváme každý den. V rámci našeho týmového projektu jsme se zabývali
možnostmi detekce některých mikroorganismů v různých prostředích pomocí metod
světelné mikroskopie. Jedněmi z pro člověka nejdůležitějších jsou i probiotika, která
jsou s námi ve styku úplně nejtěsnějším a bez nichž by byl náš život mnohem
složitější a nepříjemnější. Ve své části týmového projektu jsem se pokusil shrnout
nejdůležitější
rody,
případně
významné
druhy
probiotik,
ve
stručnosti
je
charakterizovat a následně v praktické části ověřit možnosti jejich pozorování jednou
z metod světelné mikroskopie – metodou procházejícího světla.
1
2. Současný stav řešené problematiky
2.1 Probiotika
Definice probiotik zformulovaná FAO a WHO v jejich společné zprávě na toto téma
zní: živé mikroorganismy, které, jsou-li přítomné (podávané) v přiměřeném množství,
prospívají zdravotnímu stavu hostitele [48]. [2]
První teorie o existenci probiotik se objevila před circa stoletím, kdy laureát Nobelovy
ceny Ilya Metchnikoff zaznamenal, že zdraví bulharských venkovanů a vysoký věk,
jehož se dožívali, plynul z konzumace kvašených mléčných produktů [37].
Metchnikoff si uvědomil, že kvasné bakterie při požití pozitivně ovlivňují mikrobiální
flóru střev (zažívacího traktu) [31]. [1]
Většina probiotik přijímaná člověkem se do těla dostává z běžně přijímaných potravin
obsahujících střevní druhy lactobacillů a bifidobakterií. Již z definice probiotik
vyplývá, že konzumace (příjem) probiotik přímo ovlivňuje složení střevní mikroflóry.
[49] Tento vliv probiotik na střevní ekosystém více či méně příznivě působí na
konzumenta.
Některé
z mnoha
pravděpodobných
(předpokládaných)
efektů
vyplývajících ze změn způsobených probiotiky v intestinálním prostředí jsou [49]:

Zvýšená odolnost k infekčním onemocněním, zvláště zažívacího traktu

Kratší trvání průjmových onemocnění

Snížení krevního tlaku

Snížení koncentrace cholesterolu v séru

Vyšší odlonost proti alergiím

Potlačení tumorů

Snížení produkce karcinogenů
2
V dnešní době nejvíce využívanými probiotiky jsou Laktobacily a Bifidobakterie.
Stručný přehled nejdůležitějších probiotik je uveden v tabulce 1.
Většina probiotik náleží do rodů Lactobacillus a Bifidobacterium, kdežto S. cerevisiae
boulardii je jedinou kvasinkou s prokázanými probiotickými účinky. Podle Saiera a
Mansoura [38] disponují třemi mechanismy podpory lidského zdraví:
I. Poskytují konečné produkty anaerobické fermentace uhlohydrátů, jako například
organické kyseliny, které mohou být absorbovány hostitelem. Tyto produkty ovlivňují
náladu, pocit energie a také kognitivní schopnosti.
II. úspěšně soupeří s patogeny a omezují je tak v růstu a množení
III. produkcí specifických polysacharidů stimulují imunitní reakci hostitele
Je velmi důležité zmínit, že zdravotní přínosy probiotik jsou vázány na konkrétní
kmen a nedají se generalizovat a přiřadit jednotlivým druhům či dokonce rodům.
Z tohoto důvodu žádný probiotický kmen nemůže poskytnout všechny možné přínosy
(druhu, rodu, …) [39]. Nicméně je prokázáno, že obvyklým přínosem většiny probiotik
v tabulce 1 je, na základě kompetitivní inhibice patogenních organismů, jejich
schopnost pomáhat, případně zabraňovat průjmovým onemocněním [37]. I proto je
klíčovým kriteriem pro zařazení některého mikroorganismu mezi probiotika jeho
schopnost přežít průchod horní částí trávicího ústrojí a poté kolonizovat střeva [38],
[40]. [1]
3
2.2 Prokaryotní probiotika
2.2.1 Bacillus
Obr. 1
Bacillus subtilis a využtí různých barviv (A-crystal violet, B-methylene blue, C-carbol
fuschin) při jeho pozorování světelným mikroskopem
Bacilly jsou gram-pozitivní aerobní nebo fakultativně anaerobní, velké, tyčinkovité
bakterie [46]. Některé druhy mají na jednom konci buňky svazek peritrichálních bičíků
a jsou tedy pohyblivé [46].
Rod Bacillus zahrnuje mnoho druhů bakterií, které mohou být užitečné v rozkladu
trávicích toxinů. Přirozená vrstva hlenu ve spodní části zažívacího traktu je někdy
náchylná k oslabení, což může způsobit zažívací potíže. Některé druhy Bacillů
pomáhají tuto vrstvu udržet v dostatečné tloušťce. [49]
4
Rod Bacillus je také jednou z hlavních skupin bakterií podílejících se na mléčném
kvašení. Bakterie z této skupiny mohou upravovat pH v zažívacím traktu (? střev) a
produkcí antimikrobiálních látek působí proti (potlačují) patogenům a stimulují
imunomodulační buňky a produkci laktázy. Důležitou funkcí bakterií rodu Bacillus je
tvorba bariéry proti mikrobiálním infekcím. [49]
Bakterie rodu Bacillus mají schopnost sporulace. Bakteriální spory jsou v přírodě
způsobem, jak bakterie přežívají nepříznivé životní podmínky, dokonce takové, které
by bakteriální buňky za normálních okolností zničily. Bakterie dokáží v této formě
setrvat po velmi dlouhou dobu [47]. Uchýlení se ke sporulaci bývá reakcí na pokles
koncentrace živin v bezprostředním okolí bakteriální (živé) buňky. Ve chvíli, kdy
bakterie úbytek živin zaznamená, započne proces tvorby spory, a to již po circa 8
hodinách od chvíle, kdy bakterie úbytek živin zaregistruje. (Obr. 2) [7]. Podstatou
přežití ve formě spory (endospory) je její struktura, která ve svém jádře obsahuje
kondenzovaný (zhuštěný) inaktivní chromozom.
Sporu dále obklopují podpůrné
(doplňkové) vrstvy, jako například vrstva bohatá na peptidoglykan a jedna nebo více
vrstev bílkovinných struktur nazývaných obal spory [8]. Spora je tak odolná proti UV
záření, vysokým teplotám (typicky 80 – 85 stupňů Celsia), působení rozpouštědel,
peroxidu vodíku a enzymů. Bakteriální spora je dehydratovaná, ovšem vystavena
odpovídajícím podmínkám, začne pučet. Co se týče tvaru spor, liší se podle druhu
bakterie – nejčastějšími bývají sférický nebo eliptický. Spory mívají záporný
povrchový elektrický náboj a bývají mírně hydrofobní. Sporulující bakterie obvykle
spadají do dvou rodů – Bacillus a Clostridia. [2]
5
Obr. 2 Sporulační životní cyklus
schematicky ukazuje dva navzájem protichůdné životní cykly sporulujících bakterií.
V případě nedostatku živin a strádání rostoucí, vegetativní buňka (VC) projde řadou
morfologických změn, na jejichž konci je „předspóra“ (forespore) uvnitř mateřské
buňky (MC) sporangia. Po přibližně 8 hodinách se spora (S) lyzí uvolní z matřeské
buňky. Obrázek upraven podle Cutting, Simon M., 2010 [1]
Využití bakterií rodu Bacillus jako probiotik
Bakterie rodu Bacillus se jako probiotika používají již déle než 50 let. Nejvíce
prozkoumanými druhy z této skupiny jsou Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus
cereus, Bacillus coagulans a Bacillus licheniformis. Teplotně odolné spory mají velké
množství pozitiv ve srovnání s ostatními, nesporolujícími skupinami bakterií, jako
například Lactobacillus spp. Jde jmenovitě třeba o možnost, uchovávání sušených
spor
(skladování)
za
pokojové
teploty
bez
jakéhokoli
ovlivnění
pozdější
životaschopnosti. Další velkou výhodou je schopnost spory přežít nízkou hodnotu pH
v žaludku [9, 10]. [2]
6
2.2.2 Bifidobakteria
Obr. 3
Bifidobakteria pod světelným mikroskopem
Bifidobakteria
jsou
gram-pozitivní
prokaryota
přirozeně
se
vyskytující
v gastrontestinálním traktu člověka a jiných teplokrevných živočichů. Bifidobakteria
jsou považována za jedny z nejdůležitějších komensálů člověka a hrají důležitou roli
v udržování zdravého gastrointestinálního traktu. [3]
Bifidobakteria byla poprvé izolována a popsána v letech 1899-1900 Henry Tissierem.
Rod Bifidobakteria v současné době představuje více než 30 druhů, z nichž většina
byla izolována právě z gastrointestinálního traktu člověka a některých zvířat.
V současnosti známé druhy a jejich původ je souhrnně popsán v tabulce 1.
Bifidobakteria jsou charakteristická svou morfologií i fyziologií. Bifidobakteria jsou
gram-pozitivní, plyn neprodukující, anaerobní a nesporulující bakterie. Jsou
nepohyblivé a co do tvaru se jedná o tyčinky, obvykle trochu prohnuté a kyjovitého
tvaru. Často se větví. V rámci čerstvě izolovaných kmenů se však mohou tvarově lišit
7
od jednoduchých tyčinek, přes rozvětvené, stromečkovité struktury, Y a V formy až
po lžičkovité či kyjovité útvary. Přes tuto tvarovou různorodost v nepřirozených
podmínkách se ale za normálních okolností ve svém přirozeném prostředí vyskytují
v prosté tyčinkovité formě [11]. [3] Při mikroskopickém pozorování se jeví jako
drobounké
stromečkovité
struktury
s lopatkovitými
rozvětveními.
V lidském
organismu se běžně vyskytují v ústech a gastrointestinálním traktu [46].
Bififobakteria jsou striktně anaerobní [12], ovšem některé kmeny mohou kyslík
tolerovat [13]. Optimální teplota pro růst Bifidobakterií je v případě většiny lidských
kmenů 36-38C, v případě zvířecích pak o něco vyšší, 41-43C. Výjimkou jsou B.
thermacidophilum, u kterého byla prokázána maximální teplota pro růst 49,5C [14] a
B. psychraerophilum, který rostl i při teplotě 4C [13]. Bifidobakteria tolerují kyselé
prostředí a optimální pH pro jejich růst je mezi pH 6.5-7. Kmeny B. lactis a B animalis
přežijí i v prosředí o pH 3.5 [14], kdežto Bifidobakteria pokusně vystavená pH 8.5
v tomto prostředí nepřežila [15]. Buněčná stěna Bifidobakterií má typickou grampozitivní
strukturu
sestávající
ze
silné
peptidoglykanové
obálky
obsahující
polysacharidy, bílkoviny a kyselinu teichoovou [16]. Bifidobakteria jsou sacharolytické
organismy a většina z nich má schopnost fermntace glukózy, galaktózy a fruktózy. [3]
Tyto mikroorganismy přispívají k degradaci nestrávených polysacharidů v tlustém
střevě (tračníku). Jinak řečeno, jsou to rozkladači (destruenti) v zažívacím traktu. Bez
pomoci (působení) bakterií rodu Bifidobacterium by docházelo k mnohem častějšímu
podráždění v trávicí soustavě a poruchám trávení. Metabolismus hostitele je vlastně
de-facto závislý na mikroflóře ve spodní části trávicí trubice (tenkém a tlustém
střevě). Nebýt schopnosti bakterií rodu Bifidobacterium rozkládat nedokonale
strávené zbytky potravy, nemělo by lidské tělo žádný nástroj, jak si s nestrávenými
zbytky potravy poradit. [49]
Některé z těchto druhů bakterií jsou dobře známé díky jejich častému využití
v potravinářství, zvláště v mlékárenské a pekařské výrobě. [49]
8
Nejdůležitější druhy:
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium infantis
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium breve
2.2.3 Lactobacillus
Obr. 4
Lactobacillus rhamnosus GG pod světelným mikroskopem
Bakterie rodu Lactobacillus byly mezi prvními organismy využívaných člověkem
v potravinářském průmyslu. [4]
Rod Lactobacillus byl poprvé popsán Beijerinckem v roce 1901. V roce 1919 jej OrlaJensen
rozdělil do
tří
podrodů
- Thermobacterium,
Streptobacterium
and
Betabacterium – podle optimální teploty růstu a postupu fermentace hexózy.
V oučasnosti se Bifidobakteria dělí do tří skupin podle fenotypu – výhradně obligátně
9
(výhradně) homofermentační, fakultativně homofermentační a obligátně (výhradně)
heterofermentační [17]. [4]
Laktobacily jsou gram-pozitivní nesporulující bakterie tyčinkovitého tvaru. Všechny
vyvolávají kvašení. Jsou aerotolerantní nebo anaerobní, acidurické nebo acidofilní a
mají úzce definované nároky na výživu (vyžadují uhlohydráty, aminokyseliny, peptidy,
estery mastných kyselin, soli, deriváty nukleových kyselin, vitaminy) [16]. Při využití
glukózy jakožto zdroje uhlíku při kultivaci mohou být Laktobacily homofermentační
(produkují více než 85% kyseliny mléčné) nebo heterofermentační (produkují
kyselinu mléčnou, oxid uhličitý, ethanol a (nebo) kyselinu octovou). [4]
Laktobacily jsou všudypřítomné. Můžeme je najít kdekoli, kde mají dostatek živin –
uhlohydrátů. Kolonizují různá místa v těle člověka či zvířat, například sliznice ústní
dutiny, střeva či vaginu. Laktobacily se krátce po narození ve velkém počtu vyskytují
v gastrointestinálním traktu. Ve zdravém lidském organismu se vyskytují v ústní
dutině, ileu a tračníku. Jsou také dominantními mikroorganismy ve vagině [18, 19,
20]. [4]
Bakterie rodu Lactobacillus jsou důležité pro potravinářský průmysl. Nejčastěji jsou
využívány v mlékárenství. Jsou typicky přítomné v přírodním jogurtu a zakysaných
mléčných výrobcích. Jejich důležitou vlastností je schopnost fermentace sacharidů
na laktát [46]. Některé studie zabývající se touto skupinou bakterií se však kromě
toho zaměřily i na nemlékárenské zdroje Lactobacillu. Cílem těchto studií bylo najít
zdroj respektive vyvinout přípravek, který by mohli přijímat i pacienti trpící intolerancí
laktózy. [49]
Schopnost bakterií rodu Lactobacillus přilnout ke slizničním povrchům (tkáním) střev
a jejich následné dlouhodobé či krátkodobé kolonizace je dlouhodobě jedním
z nejčastějších důvodů pro volbu těchto probiotik. [49]
Mnoho druhů bakterií ze skupiny Lactobacillus je také schopno produkovat přírodní
antibiotika
s širokým
spektrem
účinnosti (působnosti).
Jiné
příznivé
účinky
Lactobacillu zahrnují zlepšení imunity, lepší vstřebávání živin a omezení vázání
patogenů ve střevech. [49]
10
Přínos bakterií rodu Lactobacillus
inhibice
patogenních
organismů,
jako například
Salmonella,
Shigella
nebo
Helicobacter [22, 23, 24, 25, 26]. Bakterie z rodu Lactobacillus také pomáhají snížit
intoleranci laktózy [27] a zlepšují imunitní reakci organismu [28]. Přínos působení
těchto bakterií byl dokonce zaznamenán i při léčbě rakoviny [29, 30], zvláště pak
rakoviny tračníku [31, 32]. [21]
Nejdůležitější druhy:
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus sporogenes
Lactobacillus salvarius
11
2.2.4 Lactobacillus acidophilus
Obr. 5
Lactobacillus acidophilus pod světelným mikroskopem
Lactobacillus acidophilus se v lidském organismu přirozeně vyskytuje v ústech,
v trávicím traktu a ve vagině. Označován jako „zdravá“ bakterie pomáhá
Lactobacillus acidophilus v obraně před infekcemi a mnoha onemocněními.
Lactobacillus acidophilus je v lidském organismu užitečný v mnoha směrech –
účastní se při štěpení potravy a produkuje tak peroxid vodíku, kyselinu mléčnou a
další sloučeniny, které vytváří kyselé, nepřátelské prostředí pro člověku škodlivé
organismy. [49]
L. acidophilus také produkuje laktázu, enzym, měnící laktózu (mléčný cukr) na
jednoduché cukry. Díky této své schopnosti může být příjem Lactobacillus
acidophilus pomocí v léčbě pacientů s intolerancí laktózy. [49] Kromě přijímání
Lactobacillus acidophilus v běžných potravinách (je přítomen například v jogurtech)
může být Lactobacillus acidophilus užíván i jako doplněk stravy ve formě tablet,
roztoku, případně v práškové formě. [49]
12
Přínos Lactobacillus acidophilus [49]
Je prevencí proti kvasinkovým infekcím
Pomáhá při vstřebávání živin
Snižuje intoleranci lakózy
Snižuje vedlejší účinky antibiotik
Bezpečnost užívání Lactobacillus acidophilus
V souvislosti s užíváním Lactobacillus acidophilus se vyskytly i nežádoucí obtíže. Na
počátku užívání Lactobacillus acidophilus se může vyskytnout krátkodobě nadměrná
plynatost. Tento stav se však postupně zlepšuje v čase užívání Lactobacillus
acidophilus tak, jak si tělo na přítomnost bakterie zvyká. [49]
2.2.5 Streptococcus thermophilus
Streptococcus thermophilus je termofilní bakterie mléčného kvašení velice důležitá
v mléčném průmyslu. Tento druh se používá jako kvasná kultura při produkci
kvašených mléčných výrobků. Je přitom využíváno jeho schopnosti katabolicky
přeměňovat laktózu na kyselinu mléčnou, čímž přispívá k acidifikaci mléka a jeho
organoleptickým vlastnostem [33]. V současnosti je S. thermophilus považován za
druhý nejdůležitější průmyslový druh bakterie mléčného kvašení hned po
Lactococcuslactis. S. thermophilus produkuje bakteriociny inhibující Clostridie,
Listeria monocytogenes, enteropatogenické and gram-negativní bakterie [34] a
uplatňuje se tak také jako přírodní konzervant omezující růst patogenních bakterií a
bakterií a bakterií způsobujících kazení mléčných výrobků. [5]
Bakteriální kmen Streptococcus thermophilus byl znám jako důkaz zdraví
intestinálního traktu. Streptococcus thermophilus se spolu s Lactobacillus bulgaricus
brzy staly prvními kmeny bakterií využívaných při výrobě jogurtů, kde jsou využívány
doposud. [49]
Buněčná struktura Streptococcus thermophilus umožňuje bakterii snášet prostředí
s vysokou teplotou, čehož je využíváno v mlékárenském průmyslu, kde je při většině
13
fermentačních procesů vysoká teplota vyžadována. Streptococcus thermophilus také
postrádá geny obsahující povrchové proteiny. To je důležité, protože škodlivé
bakterie využívají tyto povrchové proteiny k napojení (přichycení) na slizniční tkáň a
skrytí se tak před zásahem imunitního systému.Streptococcus thermophilus
produkuje také exopolysacharidy, které jsou velmi důležité pro texturu produktů
mléčného kvašení a také pro produkci mléčných výrobků se sníženým obsahem
tuku, které si jinak uchovávají vlastnosti a pozitiva jejich plnotučných ekvivalentů.
Jednou z jedinečných vlastností Streptococcus thermophilus je schopnost rozkládat
casein, což je protein vyskytují se v mléčných produktech, například v sýrech.
Bakterie jej rozloží na peptidy a aminokyseliny, které jsou nutné k vytvoření struktury
a chuti nízkotučných sýrů. [49]
2.2.6 Enterococcus faecium
Obr. 6
Enterococcus faecalis pod světelným mikroskopem
Rod Enterococcus je jednou ze skupin mikroorganismů spadajících do kategorie
bakterií mléčného kvašení. [6]
14
Enterokoky jsou gram-pozitivní, fakultativně anaerobní nesporulující bakterie. Ideální
teplota pro růst těchto bakterií je 35C, mohou však růst v širokém pásmu teplot – od
10 do 45C. Mohou dokonce růst i v prostředí obsahujícím 6,5% NaCl a při pH 9,6
[35]. Do dnešní doby bylo popsáno na 28 různých druhů bakterií rodu Enterococcus
(jmenovitě E. faecium, E. canis, E.avium, E. asini, E. gallinarum, E. columbae, E.
phoeniculicola, E.flavescens, E. moraviensis, E. haemoperoxidus, E.saccharolyticus,
E. villorum, E. casseliflavus, E. dispar, E.durans, E. faecalis, E. mundtii, E. gilvus, E.
hirae, E.malodoratus, E. pallens, E. pseudoavium, E. raffinosus, E.cecorum, E. ratti,
E. solitarius, E. sulfureus, and E.saccharominimus [36]. Buňky E. faecium jsou
nepohyblivé, vejčitého tvaru a tvoří obvykle páry nebo krátké řetězce. E. faecium
tvoří hladké (smooth) kruhovité celistvé kolonie. Enterokoky dokáží přežít i ve značně
extrémních podmínkách a jsou tepelně nejodolnější z nesporulujících bakterií.
Odolávají i pasterizačním teplotám a vykazují růst na různých substrátech, v širokém
rozsahu teplot i za extrémního pH či salinity. [6]
Enterokoky jsou bakterie běžně se vyskytující v lidském a zvířecím intestinálním
traktu. Do potravin se mohou dostat přímou nebo nepřímou kontaminací během
zpracování a obvykle jsou přítomny v kvašených produktech, jako sýry, párky, olivy
atp. V současnosti jsou podrobně studovány, protože produkují bakteriociny
(enterociny),
způsobujících
které
zkázu
zabraňují
potravin,
v růstu
jako
mnoha
jsou
patogenů
Staphylococcus
a
mikroorganismů
aureus,
Listeria
monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas spp., Bacillus spp. a Clostridium
spp. [6]
15
2.3 Eukaryotní probiotika
2.3.1 Saccharomyces boulardii
Kvasinka Saccharomyces boulardii je důležitým probiotikem schopným rekolonizovat
a udržovat mikroflóru v tenkém a tlustém střevě. Saccharomyces boulardii je
klasifikována jako nesystémová (non-systemic) a nepatogenní. Její výskyt a
působnost se omezuje pouze na intestinální trakt a nijak se nešíří do dalších oblastí
organismu. Často je prodávána v lyofilizované (mrazem sušené) formě. [49]
Přínos Saccharomyces boulardii [49]:
Reguluje různé druhy průjmových onemocnění
Snižuje pravděpodobnost výskytu akutních průjmů
Snižuje pravděpodobnost návratu Pseudomembranous Colitis
Snižuje četnost pohybu tračníku u pacientů se syndromem dráždivého tračníku
Zmírňuje průjem způsobený jako vedlejší účinek užívání antibiotik
Safety of Saccharomyces boulardii:
S. boulardii je obvykle dobře snášena. Při jejím užívání se mohou projevit vedlejší
účinky, typické pro mnoho probiotik, jako nadýmání, plynatost, zácpa a zvýšený pocit
žízně. Tyto vedlejší účinky se zmírňují s četností (pravidelností) užívání S. boulardii.
Užívání S. boulardii může být nebezpečné a nedoporučuje se tedy lidem alergickým
na kvasinky. Případné užívání S. boulardii jako doplňku stravy může být nebezpečné
také pro pacienty s oslabeným imunitním systémem, kdy hrozí rozvinutí houbové
infekce v organismu. Onemocnění tohoto původu ale u zdravých pacientů
pozorovány nebyly. Některé druhy antibiotik mohou oslabit kolonie Saccharomyces
boulardii v organismu. Saccharomyces boulardii by se také neměla užívat s medikací
proti průjmovým onemocněním. [49]
16
2.3.2 Sacharomyces cerevisiae
Obr. 7
Saccharomyces cerevisiae při 1000 násobném zvětšení
Sacharomyces cerevisiae, což v latině znamená „cukrová houba“ je lidem známa a
využívána již několik tisíc let. Uvádí se, že poprvé byla objevena na slupkách hroznů.
Saccharomyces cerevisiae je jinak známa jako pekařská nebo pivovarnická kvasinka.
Již od antiky se používá při kynutí těsta či k výrobě alkoholických nápojů.
Saccharomyces cerevisiae se masověji rozšířila v druhé polovině 19. Století
zásluhou Louise Pasteura, díky jehož výzkumu se dala produkovat v komerčním
měřítku jako přísada do těsta a při alkoholovém kvašení. [49]
Její
podrobně
prostudovaná
a
popsaná
buněčná
stavba
(struktura)
činí
Sacharomyces cerevisiae, známou častěji jako pivovarnická kvasinka, jedním
z nejprozkoumanějších organismů na zemi. Sacharomyces cerevisiae se vyskytuje
v jednobuněčné formě, případně ve formě pseudomycelia. Buněčná reprodukce
probíhá pučením. Od ostatních kvasinek odlišuje Sacharomyces cerevisiae její
zvláštní schopnost kvašení některých cukrů. [49]
Sacharomyces cerevisiae existuje (a roste) v haploidní a diploidní buněčné formě.
Happloidní buněčný cyklus sestává z mitózy, růstu a smrti, která je mnohem rychlejší
17
v případě extrémně nepříznivých podmínek. Diploidní buňka také prochází mitózou,
fází růstu, ale za stejně nepříznivých podmínek je schopna sporulace – vytvoření
spor a přežití v této formě. V případě sporulace pak buňka prochází meiózou a
produkuje množství haploidních spor. Tyto haploidní spory poté dospívají a
rozmnožují se [49]
Přínos Sacharomyces cerevisiae
Již v množství dvou lžic denně je Sacharomyces cerevisiae, v podobě komerčního
preparátu, známého jako „nutriční kvasinka“ , schopna pokrýt 52 % doporučené
denní dávky bílkovin. Sacharomyces cerevisiae je také bohatá na vlákninu, vitaminy
B a kyselinu listovou. Neobsahuje také žádný lepek a je tedy vhodná i pro pacienty
trpící celiakií. [49]
Bezpečnost užívání S. cerevisiae:
Jediný známým vážnějším nebezpečím při konzumaci
S.cerevisiae je možnost
kolonizace lymfatických cest a uzlin. K tomuto ale došlo u laboratorních zvířat pouze
při podávání extrémních dávek přípravku a užívání S. cerevisiae tak bylo označeno
za bezpečné. [51, 49]
Navzdory
tomu,
že
S.
cerevisiae
není
obecně
považována
za
infekční
mikroorganismus, je evidováno několik případů infekčích onemocnění způsobených
S. cerevisiae. U všech pacientů s těmito obtížemi se ale jednalo o lidi s jinými
vážnými zdravotními problémy, přičemž někteří z nich navíc užívali antibiotika, která
zahubila užitečné bakterie a umožnila tak růst S. cerevisiae. [49] S. cerevisiae
neprodukuje žádné látky toxické pro lidský nebo jakýkoli živočišný organismus. Může
však produkovat toxiny hubicí ostatní kvasinky. Je proto využívána v potravinářství i
k zabránění kolonizování pracovišť, ve kterých probíhá kvašení, jinými druhy
kvasinek. [49]
Velmi vzácně také S. cerevisiae může způsobit vaginitis. Podle studie v Journal of
Clinical Microbiology z roku 1999 byla v malém, bohužel ale stále se zvyšujícím,
množství případů zaznamenána přítomnost S. cerevisiae v pohlavním ústrojí
těhotných žen. [50, 49]
18
V literatuře uváděné nejdůležitější probiotické mikroorganismy
Druh
Lactobacillus
Lactobacillus
rhamnosus GG
Lactobacillus casei
Lactobacilluscasei
Shirota
Lactobacillus
acidophilus
Lactobacillus
johnsonii
Lactobacillus
plantarum
Bifidobacteria
Bifidobacterium
breve
Bifidobacterium
bifidum
Bifidobacterium
infantis
Bifidobacterium
animalis
Kvasinky
Saccharomyces
cerevisiae Boulardii
Účinky na lidské zdraví
Napravuje změny průchodnosti trávicí
soustavy způsobené kravským mlékem či
rotavitovými infekcemi. Může zkrátit průběh
rotavirových infekcí způsobujících průjem a
průjmy způsobené úžíváním antibiotik.
Snižuje závažnost a dobu trvání průjmových
onemocnění. Stimuluje imunitní systém trávicí
soustavy. Zmírňuje průběh Crohnovy choroby
a má silné antimikrobiální účinky.
Zamezuje vzniku průjmů způsobených viry a
bakteriemi. Má největší přínos pro lidské
zdraví co se týče poruchy vstřebávání laktózy,
rotavirových průjmů, průjmů způsobených
antibiotiky a průjmů způsobených Clostridium
difficile. Má preventivní účinky ve vztahu
k četnosti návratu rakoviny superficialbladder
Produkuje kyselinu mléčnou, která snižuje pH
střevního obsahu a zpomaluje (blokuje) rozvoj
invazivních patogenů jako Salmonellaspp.
Nebo Escherichia coli. Stimuluje tvorbu
protilátek a pomáhá snižovat hladinu
cholesterolu.
Snižuje množství Helicobacterpylori a zmírňuje
záněty trávicí soustavy.
Produkuje mastné kyseliny s krátkým
řetězcem, které tlumí enzymovou aktivitu a
snižují tvorbu karcinogenních látek.
Zvyšuje produkci anti-rotavirových IgA a
aktivuje tak humorální imunitní systém.
Ubírá živiny a prostředí patogenním a
hnilobným bakteriím a tlumí tak jejich růst.
Odkaz
Zabraňuje vzniku průjmu a zácpy.
42
Pomáhá obnovovat správnou peristaltiku po
zácpě. Snižuje riziko vzniku akutních
průjmových onemocnění u dětí i dospělých.
Předchází vzniku cestovních průjmových
onemocnění a rozvoji kolitidy a enterokolitidy
patogenického původu. Snižuje
pravděpodobnost vzniku a trvání průjmu po
užívání antibiotik.
41
39,
40, 41
39, 43
39,
40, 44
39
39
41
40, 44
37, 43
42, 45
Tab.1 [1]
19
3. Světelné mikroskopické techniky používané pro pozorování mikroorganismů
Pozorování v temném poli
Jinak také metoda zástinu se používá zejména v bakteriologii a protozoologii
k pozorování jinak těžko pozorovatelných povrchových buněčných struktur. Tato
metoda spočívá v umístění clony, která způsobuje pohlcení centrálních paprsků a do
roviny pozorovaného objektu tak vstupují ze světelného zdroje jen šikmo dopadající
světelné paprsky. Ve výsledku pak pozorujeme zářící objekt na tmavém podkladu.
[53, 54, 55, 56]
Metoda fázového kontrastu
Je využívána hlavně při mikroskopování živých nezbarvených preparátů. Metoda
fázového kontrastu využívá různé optické hustoty (indexů lomu) jednotlivých struktur
pozorovaného objektu. Díky tomu dochází k nestejnému lomu světla na rozhraních
struktur a posunu fáze světelného záření – vzniká tzv. refrakční obraz. Nezbarvené
preparáty se jinak nazývají fázové objekty. [54, 55, 56]
Interferenční mikroskopie
Tato metoda umožňuje detailní pozorování živých tkání a užívá se jako rychlá
diagnostická metoda v mikrobiologii a parazitologii. Principielně se jedná o metodu
podobnou metodě fázového kontrastu. Využívá se polarizovaného světla. Každý
paprsek nejprve rozdělíme na dva, kdy jeden prochází volně prostředím, kdežto
druhý prochází pozorovaným objektem. Díky rozdílným optickým hustotám dochází
ke zpoždění paprsku procházejícího pozorovaným objektem. V objektivu se pak oba
paprsky setkávají a interferují, což má za následek změnu amplitud, která vede ke
změně intenzity světelného záření, čímž se zvýší kontrast mezi jednotlivými
strukturami. [55, 56]
20
Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
Nomarského diferenciální
interferenční
kontrast je založen na detekci fázového
posunu polarizovaného světla, ke kterému dochází na dvojlomných hranolech tzv.
Wollastonova typu. Výhodou této metody je možnost pozorování struktur, které jinak
ve světlém poli pozorovatelné nejsou. Na rozdíl od metody fázového kontrastu navíc
nedochází k tzv. halo efektu. [54, 57]
Metoda Hoffmanova modulačního kontrastu
Jako zdroj světla je u této metody využito záření vstupující šikmo do obdélníkové
štěrbiny, která je umístěna v přední ohniskové rovině kondenzoru. V místě štěrbiny je
vložen modulátor, což je maska s různou propustností v jednotlivých oblastech.
Záření ze zdroje prochází obdélníkovou štěrbinou, kondenzorem a dopadá na
pozorovaný
objekt.
S měnící
se
optickou
tloušťkou
v jednotlivých
částech
pozorovaného objektu dochází k vychýlení záření z původního směru. Výsledkem je
změna jasu a výraznější kontrast výsledného obrazu. [57]
Fluorescenční mikroskopie
Podstatou této metody je luminiscence, což je jev, kdy daný objekt po předchozím
dodání energie v podobě elektromagnetického záření o kratších vlnových délkách
má schopnost vyzařovat elektromagnetické záření o delších vlnových délkách. Na
pozorovaný objekt (případně jeho část) se aplikuje chemická fluoreskující látka, která
po dopadu UV záření vyzáří světlo z viditelné části spektra. To pak detekujeme
v mikroskpu.
Fluorescenční
mikroskopie
se
uplatňuje
zejména
v lékařské
diagnostice. Touto metodou lze také zobrazit látky, které jsou v buňkách obsaženy ve
velmi malém množství. [52, 54, 55]
21
4. Experimentální část
Materiál
- probiotické tablety BIFIFORM KID, Ferrosan A/S, 2860 Soeberg, Dánsko (obsahuje
Lactobacillus rhamnosus GG, Bifidobacterium lactis)
- destilovaná voda
Pomůcky
- střička
- Petriho misky
- pipeta
- kádinky
Přístrojové vybavení
- mikroskop Olympus ….
Pracovní postup
1. Tablety přípravku BIFIFORM KID jsem rozpustil v malém množství destilované
vody
2. Ze vzniklého roztoku jsem připravil mikroskopický preparát podle následujícího
postupu:
a) doprostřed očištěného podložního sklíčka jsem pipetou umístil kapku
připraveného roztoku přípravku BIFIFORM KID
b) kapku jsem opatrně přikryl krycím sklíčkem tak, aby se v preparátu nevytvořily
vzduchové bubliny (krycí sklíčko jsem nejdříve umístil na hranu a poté jej zvolna
přiklopil)
3. preparát jsem umístil pod mikroskop
4. zahájil jsem pozorování
Výsledky a hodnocení
Lactobacillus rhamnosus GG
- jednalo se o pravidelné tyčinkovité bakterie
- povětšinou roztroušeny po jedné či po dvojicích
- gram-pozitivní
22
Bifidobacterium lactis
- nepravidelné, tyčinkovitého tvaru
- často ve shlucích
- gram-pozitivní
23
5. Závěr
V rámci týmového projektu jsem se zpracoval teoretickou část práce cílenou na
současný stav řešené problematiky v oblasti probiotik a jejich použití v medicíně.
Zaměřil jsem se zejména na probiotické kultury a prostředky, s jejich pozitivním
vlivem na lidský organizmus, trávicí a imunitní systém. Dále jsem zpracoval krátký
přehled o používaných metodách světelné mikroskopie vhodných pro detekci
mikroorganizmů.
V experimentální části jsem se pak seznámil s přípravou mikrobiologického
mikroskopického preparátu z vybraného farmaceutického probiotického prostředku.
S přípravou a archivací mikroskopické fotodokumentace. Tuto část práce je třeba
rozšířit o další vybraná probiotika, detekci mikroorganizmů a ve spolupráci s lékařem
provést zhodnocení použitých probiotik v medicíně.
Výsledky získané řešením týmového projektu využiji při zpracování bakalářské práce.
24
6. Literatura
[1] FIGUEROA-GONZÁLEZ, Ivonne, Guillermo QUIJANO, Gerardo RAMÍREZ a
Alma CRUZ-GUERRERO. Probiotics and prebiotics-perspectives and challenges.
Journal of the Science of Food and Agriculture. 91(8), s. 1341-1348.
DOI: 10.1002/jsfa.4367. Dostupné z:
http://doi.wiley.com/10.1002/jsfa.4367
[2] CUTTING, Simon M., Guillermo QUIJANO, Gerardo RAMÍREZ a Alma CRUZGUERRERO. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28(2), s. 214-220.
DOI: 10.1016/j.fm.2010.03.007. Dostupné z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0740002010000493
[3] LEAHY, S.C., D.G. HIGGINS, G.F. FITZGERALD a D. SINDEREN. Getting better
with bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology. 98(6), s. 1303-1315.
DOI: 10.1111/j.1365-2672.2005.02600.x.
Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1365-2672.2005.02600.x
[4] BERNARDEAU, Marion, Micheline GUGUEN, Jean Paul VERNOUX a D.
SINDEREN. Beneficial lactobacilli in food and feed: long-term use, biodiversity
and proposals for specific and realistic safety assessments. FEMS Microbiology
Reviews. 30(4), s. 487-513. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2006.00020.x.
Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1574-6976.2006.00020.x
[5] MORANDI, S., M. BRASCA, Jean Paul VERNOUX a D. SINDEREN. Safety
aspects, genetic diversity and technological characterisation of wild-type
Streptococcus thermophilus strains isolated from north Italian traditional cheeses:
long-term use, biodiversity and proposals for specific and realistic safety
assessments. Food Control. 23(1), s. 203-209.
DOI: 10.1016/j.foodcont.2011.07.011. Dostupné z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0956713511002842
25
[6] JAVED, Adeel, Tariq MASUD, Qurat AIN, Mohmmad IMRAN a Shabana
MAQSOOD. Enterocins of Enterococcus faecium, emerging natural food
preservatives: long-term use, biodiversity and proposals for specific and realistic
safety assessments. Annals of Microbiology. 61(4), s. 699-708.
DOI: 10.1007/s13213-011-0223-8. Dostupné z:
http://www.springerlink.com/index/10.1007/s13213-011-0223-8
[7] Errington, J., 2003. Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis. Nat.
Rev. Microbiol. 1,117e126.
[8] Henriques, A.O., Moran Jr., C.P., 2007. Structure, assembly, and function of the
spore surface layers. Annu. Rev. Microbiol. 61, 555e588.
[9] Barbosa, T.M., Serra, C.R., La Ragione, R.M., Woodward, M.J., Henriques, A.O.,
2005. Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl.
Environ. Microbiol. 71, 968e978.
[10] Spinosa, M.R., Braccini, T., Ricca, E., De Felice, M., Morelli, L., Pozzi, G.,
Oggioni, M.R 2000. On the fate of ingested Bacillus spores. Res. Microbiol. 151,
361e368.
[11] Rašić, J.L. and Kurmann, J.A. (1983) Bifidobacteria and Their Role. Basel,
Switzerland: Birkhäuser AG.
[12] Scardovi, V. (1984) Genus Bifidobacterium Orla-Jensen. In Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology, Vol. 1. ed. Kreig, N.R. and Holt, J.G. pp. 1418–1434.
Baltimore, MD: Williams and Wilkins.
[13] Simpson, P.J., Ross, R.P., Fitzgerald, G.F. and Stanton, C. (2004)
Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov and Aeriscardovia aeriphila gen. nov.,
sp. nov., isolated froma porcine caecum. Int J Syst Evol Microbiol 54, 401–406.
26
[14] Dong, X., Xin, Y., Jian, W., Liu, X. and Ling, D. (2000) Bifidobacterium
thermacidophilum sp. nov., isolated from an anaerobic digester. Int J Syst Evol
Microbiol 50, 119–125.
[15] Biavati, B., Vescovo, M., Torriani, S. and Bottazzi, V. (2000) Bifidobacteria:
history, ecology, physiology and applications. Ann Microbiol 50, 117–131.
[16] Gomes, A.M.P. and Malcata, F.X. (1999) Bifidobacterium spp. And Lactobacillus
acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties
relevant for use as probiotics. Trends Food Sci Technol 10, 139–157.
[17] Kandler O &Weiss N (1986) Regular, Nonsporing Gram-Positive Rods. Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (Williams & Wilkins, eds), pp. 1261–
1434. Baltimore, MD.
[18] Hill GB, Eschenbach DA & Holmes KK (1984) Bacteriology of the vagina. Scand
J Urol Nephrol 86: 23–39.
[19] Forsum U, Holst E, Larsson PG, Vasquez A, Jakobsson T & Mattsby-Baltzer I
(2005) Bacterial vaginosis – a microbiological and immunological enigma.
Minireview APMIS 113: 81–90.
[20] Merk K, Borelli C & Korting HC (2005) Lactobacilli – bacteriahost interactions
with special regard to the urogenital tract. Int J Med Microbiol 295: 9–18.
[21] MARAGKOUDAKIS, Petros A., Georgia ZOUMPOPOULOU, Christos MIARIS,
George KALANTZOPOULOS, Bruno POT a Effie TSAKALIDOU. Probiotic
potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products: long-term use,
biodiversity and proposals for specific and realistic safety assessments.
International Dairy Journal. 16(3), s. 189-199. DOI: 10.1016/j.idairyj.2005.02.009.
Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0958694605000816
27
[22] Bernet-Camard, M. F., Lievin, V., Brassart, D., Neeser, J. R., Servin, A. L., &
Hudault, S. (1997). The human Lactobacillus acidophilus strain LA1 secretes a
nonbacteriocin antibacterial substance(s) active in vitro and in vivo. Applied
Environmental Microbiology, 63, 2747–2753.
[23] Hudault, S., Lievin, V., Bernet-Camard, M. F., & Servin, A. L. (1997).
Antagonistic activity exerted in vitro and in vivo by Lactobacillus casei (Strain
GG) against Salmonella typhimurium C5 infection. Applied and Environmental
Microbiology, 63, 513–518.
[24] Aiba, Y., Suzuki, N., Kabir, A. M. A., Tagaki, A., & Koga, Y. (1998). Lactic acid
mediated suppression of Helicobacter pylori by the oral administration of
Lactobacillus salivarious as a probiotic in a gnotobiotic murine model. American
Journal of Gastroenterology, 93, 2097–2101.
[25] Hammilton-Miller, J. M. T. (2003). The role of probiotics in the treatment and
prevention of H. pylori infection. International Journal of Antimicrobial Agents, 22,
360–366.
[26] Sgouras, D.,Maragkoudakis, P. A., Petraki, K.,Martinez-Gonzalez, B., Eriotou,
E., Michopoulos, S., Kalantzopoulos, G., Tsakalidou, E., ARTICLE IN PRESS
198 P.A. Maragkoudakis et al. / International Dairy Journal 16 (2006) 189–199 &
Mentis, A. (2004). In vitro and in vivo inhibition of Helicobacter pylori by
Lactobacillus casei strain Shirota. Applied and Environmental Microbiology, 70,
518–526.
[27] Gilliland, S. E., & Kim, H. S. (1984). Effect of viable starter culture bacteria in
yogurt on lactose utilization in humans. Journal of Dairy Science, 67, 1–6.
[28] Matsuzaki, T., Yamazaki, R., Hashimoto, S., & Yokokura, T. (1998). The effect of
oral feeding of Lactobacillus casei strain Shirota on immunoglobulin E production
in mice. Journal of Dairy Science, 81, 48–53.
28
[29] Hirayama, K., & Rafter, J. (2000). The role of probiotic bacteria in cancer
prevention. Microbes and Infection, 2, 681–686.
[30] Kopp-Hoolithan, L. (2001). Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: A
review. Journal of the American Dietetic Association, 101, 229–238.
[31] Mercennier, A., Pavan, S., & Pot, B. (2002). Probiotics as biotherapeutic agents:
present knowledge and future prospects. Current Pharmaceutical Design, 8, 99–
110.
[32] Guarner, F., & Malagelada, J. R. (2003). Gut flora in health and disease. Lancet,
361, 512–519.
[33] Giraffa, G., Paris, A., Valcavi, L., Gatti, M., & Neviani, E. (2001). Genotypic and
phenotypic heterogeneity of Streptococcus thermophilus strains isolated from
dairy products. Journal of Applied Microbiology, 91, 937e943.
[34] Ivanova, I., Miteva, V., Stefanova, T., Pantev, A., Budakov, I., Da Nova, S., et al.
(1998). Characterization of a bacteriocin produced by Streptococcus
thermophilus 81. International Journal of Food Microbiology, 42, 147e158.
[35] Schleifer KH, Kilpper-Balz R (1987) Molecular and chemo-taxonomic
approaches to the classification of streptococci, enterococci and lactococci: a
review. Syst Appl Microbiol 10:1–19
[36] Foulquie Moreno MR, Sarantinopoulos P, Tsakalidou E, De Vuyst L (2006) The
role and application of enterococci in food and health. Int J Food Microbiol
106:1–24
[37] Vasiljevic T and Shah NP, Probiotics – from Metchnikoff to bioactives. Int Dairy J
18:714–728 (2008).
[38] Saier MH and Mansour NM, Probiotics and prebiotics in human. J Mol Microbiol
Biotechnol 10:22–25 (2005).
29
[39] Shah NP, Functional cultures and health benefits. Int Dairy J 17:1262–1277
(2007).
[40] Itsaranuwat P, Shal-haddad K and Robinson PK, The potential therapeutic
benefits of consuming ‘health-promoting’ fermented dairyproducts: abrief update.
Int JDairyTechnol 56:203–210 (2003).
[41] Kaur IP, Chopra K and Saini A, Probiotics: potential pharmaceutical applications.
Eur J Pharmaceut Sci 15:1–9 (2002).
[42] Fric P, Probiotics and prebiotics – renaissance of a therapeutic principle. Cent
Eur J Med 2:237–270 (2007).
[43] De Vrese Mand Schrezenmeir J, Probiotics, prebiotics, and synbiotics. Adv
Biochem Eng Biotechnol 111:1–66 (2008).
[44] Gill HandPrasad J, Bioactive components ofmilk:probiotics,immunomodulation,
and health benefits, in Advances in Experimental Medicine and Biology, ed. By
Bösze Z. Springer, New York, NY, pp. 423–454 (2008).
[45] Priebe MG, Vonk RJ, Sun X, He T, Harmsen HJM and Welling GW, The
physiology of colonic metabolism. Possibilities for interventions with pre- and
probiotics. Eur J Nutr 41:1/2–1/10 (2002).
[46] JULÁK JAROSLAV, Úvod do lékařské bakteriologie, univerzita Karlova v Praze,
nakladatelství Karolinum, Praha 2006
[47] Nicholson, W.J., Munakata, N., Horneck, G., Melosh, H.J., Setlow, P., 2000.
Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial
environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 548e572.
[48] Araya, M., Morelli, L., Reid, G., Sanders, M.E., Stanton, C., 2002. Joint
FAO/WHO Working Group Report on Guidelines for the Evaluation of Probiotics
in Food London, Ontario. ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf.
30
[49] Dr. Rick Swartzburg, D.C., Probiotic Strains, citováno 2011 Dostupné na:
http://www.probiotic.org/probiotic-strains.htm
[50] Posteraro, B., Sanguinetti, M., D’Amore, G., Masucci, L., Morace, G. and Fadda,
G. (July 1999). ”Molecular and Epidemiological Characterization of Vaginal
Saccharomyces Cerevisiae Isolates,” Journal of Clinical Microbiology, 37 (7):
2230-2235.
[51] Wolochow, H., Hildegrand, G.J,, and Lamanna, C. (1961). “Translocation of
microorganisms across the intestinal wall of the rat: effect of microbial size and
concentration.” Journal of Infectious Diseases 116: 523-528.
[52] KOČÁREK, Eduard; PÁNEK, Martin; NOVOTNÁ, Drahuše. Klinická cytogenetika I. :
Úvod do klinické cytogenetiky. I. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8.
[53] VYMĚTALOVÁ, Veronika. Laboratorní cvičení z biologie. Praha : VŠCHT, 2001.
69 s. ISBN 80-7080-438-6.
[54] PALEČEK, Jiří. Biologie buňky I. - Základy mikroskopické cytologie. Praha :
Karolinum, 1996. 120 s. ISBN 80-7184-266-4.
[55] HABROVÁ, Věra. Mikroskopická technika. I. Praha : Státní pedagogické
nakladatelství, 1990. 158 s. ISBN 80-7066-149-6.
[56] HEJTMÁNEK, Milan. Úvod do světelné mikroskopie. V. Olomouc : Polygrafické
středisko VUP, 2001. 65 s. ISBN 80-244-0333-1.
[57] PLÁŠEK, Jaromír. Nové metody optické mikroskopie. Pokroky matematiky,
fyziky a astronomie. 1996, 41, s. 1-24. Dostupný také z WWW:
<http://dml.cz/bitstream/handle/10338.dmlcz/139719/PokrokyMFA_41-19961_1.pdf>.
31