Stáhnout materiál Bioanalytické metody 8

Imunologické metody
Obratlovci vystavení působení cizorodých molekul a organismů
reagují imunitní odpovědí,
odpovědí jejímž cílem je eliminace jejich
škodlivého vlivu.
Imunitní odpověď je dvojího typu, humorální typ - produkce a
cirkulace protilátek (antibody - Ab), odpověď na buněčné
úrovni - produkce specializovaných buněk, které reagují s
antigeny na povrchu hostitelských buněk.
Protilátky se vytvářejí ve zralých B lymfocytech, nazývaných
plazmové buňky.
buňky Ab mají specifitu proti danému antigenu,
určitá linie plazmových buněk produkuje stejné monoklonální
protilátky (MAb). Jiné linie tvoří Ab proti stejnému antigenu,
ale odlišné struktury. Vzniká tak směs - polyklonální protilátka.
Antigenní determinant neboli epitop = strukturní element
antigenu, který je rozpoznáván protilátkou. Proteiny - několik
aminokyselin, vyšší sacharidy - několik cukerných zbytků.
Z krve imunizovaných obratlovců se izoluje antisérum
(případně se přečišťuje), které obsahuje polyklonální protilátky.
Monoklonální protilátky se připravují v kulturách
hybridomových buněk,
buněk které vzniknou fúzí B buněk s rychle
se dělícími tumorovými buňkami. Alternativní cestou je
nadměrná exprese monoklon. Ab v buňkách E. coli jako
hostitelském organismu.
Struktura protilátek
Všeobecná struktura je stejná, čtyři polypeptidové řetězce,
řetězce
dvě kopie těžkého řetězce (H) a dvě kopie lehkého řetězce (L).
Vyjímkou velbloud - pouze pár těžkých řetězců.
1
Lehký řetězec má dvě formy, těžký řetězec 5 forem,
forem které se
liší v aminokyselinové sekvenci. H řetězce jsou glykosylovány.
Nekovalentní interakce řetězců, -S-S- vazby.
N-koncové části obou řetězců jsou tzv. variabilní domény vazebné místo pro antigen. Dvě identická vazebná místa.
Typ H řetězců určuje třídu:
IgA, IgD, IgE, IgG, IgM
IgA a IgG se dělí do podtříd
(indexy). IgG jsou dominantní,
IgM jsou jediné pentamerní
(1000 kDa), jinak 150-200 kDa.
Různé konc. v séru, funkce,
poločas.
Konstantní oblasti - fyziologické funkce protilátek, vazba komplementu.
2
Štěpení proteolytickým enzymem papainem probíhá mezi cH1 a
cH2, vzniknou dvě kopie tzv. Fab fragmentu (monovalentní) a
jeden Fc fragment.
Pepsin poskytuje
bivalentní F(ab)´2.
Fab =
„fragment antibody“
Bohužel se shlukují
(„sticking“), což činí
potíže při terapii.
Příprava protilátek
Imunologické metody jsou nezastupilné v biochemických, ale
zejména klinických laboratořích.
Polyklonální protilátky se připravuji imunizací laboratorních
zvířat. Nejčastěji se imunizuje biopolymery - proteiny, ale i
polysacharidy. Nukleové kyseliny jsou špatnými antigeny.
Pro kvalitu (specifitu) protilátek je nutná čistota antigenu.
Nízkomolekulární látky (peptidy, léčiva) mohou vyvolávat
imunitní odpověď po vazbě na inertní nosič. Pak se z nich
stávají tzv. hapteny.
hapteny Jako nosiče se používají např.
hemocyanin, BSA. Často se provádí několik typů konjugací
pro možnost porovnání specifity generovaných protilátek.
3
Přečištění antigenů používaných pro imunizaci
V případě proteinů je nejvýhodnější použití preparativní SDSSDSPAGE,
PAGE chromatografické metody - afinitní chromatografie.
Po preparativní ELFO se vzorek vyřízne z gelu (bez barvení,
musí být známa pozice v gelu), rozdrtí se, suspenduje v PBS
pufru a protlačuje injekční stříkačkou pro jemné rozdrcení. Pak
je možná imunizace.
Pro imunizaci se obvykle aplikuje 1 - 1000 µg proteinu
smíseného s adjuvans - funguje jako depot pro pomalé
uvolňování antigenu a nespecifický aktivátor imunitní reakce.
Freundovo adjuvans - obsahuje mannidomonooleát a
parafínový olej. JeJe-li kompletní, obsahuje dále inaktivované
mykobaktérie pro stimulaci imunitního systému zvířete.
Kompletní F.a. se užívá pouze na počátku imunizace,
imunizace dále
následuje použití inkompletního F.a. Emulze použitá pro
inokulaci musí být stabilní (ultrazvuk). V některých zemích je
použití F.a. zakázáno (SRN), alternativy.
Výběr zvířete pro přípravu antiséra závisí na množství
potřebných protilátek. Nejčastěji králík a koza.
koza
Pro první injekci s kompletním F.a. se doporučuje intramuskulární aplikace. Následující aplikace mají být podkožní.
Protokoly pro imunizaci bývají různé, obvykle trvají 35-60
dnů. Na počátku se odebere kontrolní sérum.
sérum Po počáteční
injekci se užije relativně velkého množství antigenu, pro další
injekce se toto snižuje.
4
Antigen se má aplikovat do různých míst zvířecího těla omezení fyzické bolesti. Krev králíků se odebírá z ušních žil,
žil
drastické je utrácení zvířat vykrvácením.
Po 14 dnech od první injekce se odebírá zkušební sérum pro
analýzu titru protilátky,
protilátky pak následují další injekce s menším
množstvím antigenu (aby se nevyvinula tolerance) pro
povzbuzení imutního systému za účelem vyšší produkce
protilátek.
Po dalších 14 dnech následuje další injekce pro povzbuzení
imunitního systému („booster“). Dále po týdnu může být
odebráno antisérum.
Může být i třetí injekce Ag pro povzbuzení (8 týdnů o poč.
injekce), po dalším týdnu se odebere antisérum.
5
Rupert
Purifikace protilátek
Po získání krve ze zvířete se nechá krev srazit, krevní koláč se
odstraní centrifugací při 5,000 g, připravíme tak sérum.
Sérum lze skladovat několik let při -80 oC. Doporučuje se
inaktivace komplementu zahřátím při 56 oC po dobu 10-20 min.
Pro přečištění immunoglobulinové frakce séra existuje několik
metod:
1) precipitace síranem amonným, 45% sat. pro králičí sérum
2) konvenční chromatografické techniky
3) afinitní chromatografie na nosičích protein A nebo G; Jde
o immobilizované komponenty z buněčné stěny bakterie
Streptococcus aureus (A) nebo růz. spreptokokových kmenů
(G), vážící IgG v konst. Fc regionech.
6
IgG se váží na afinitní nosič v neutrálním či slabě
alkalickém prostředí,
prostředí eluují se glycin-HCl pufrem, pH 2.7.
Nutná okamžitá neutralizace kyselého eluátu.
Podobně může být afinitní chromatografie provedena s
immobilizovaným antigenem použitým pro imunizaci
(navázání na aktivovaný nosič CNBr-Sepharosa, vinylsulfonyl
agarosa). Nanášení při neutrálních podmínkách, eluce
chaotropními látkami či nižším pH. Touto purifikací nelze získat
monoklonální protilátky, ale směs monospecifických protilátek
proti různým antigenním determinantům.
Monoklonální protilátky
7
Nanoprotilátky („nanobodies“)
Běžné protilátky mohou být přirovnány k tankům: pro léčbu
jistých onemocnění jsou velké, složité a nákladné.
Nedokonalost lidského imunitního systému: často velmi
pomalý v reakci (nádory, určité respirační infekce), jindy
naopak reaguje nadměrně (odmítnutí transplantovaných orgánů,
astma, alergie). Konečně může napadnout vlastní buňky
(revmatická artritida). Snaha produkovat umělé protilátky bez
negativních efektů – u MAb problematické a nákladné.
Velbloudi a lamy produkují ve svém imunitním systému
neúplné protilátky, které mohou být pozměněny genovým
inženýrstvím (použije se jediný variabilní segment). NanoAb
jsou pak kódovány jediným genem a mohou být snadno
produkovány expresí v hostitelském mikrobiálním organismu.
Nanoprotilátky mají velikost 1/10 běžné Ab.
Konstrukce a aplikace studovány firmou Ablynx v Gentu (Belgie).
V podobné velikosti firma Domantis (Cambridge, MA, USA)
produkuje „doménové protilátky“ – variabilní domény z Fab.
8
Interakce protilátka - antigen
Použití vysoce specifické interakce pro analýzu. Provádí se v
roztoku nebo na nosiči (gelu).
Vytvoření Ab-Ag precipitátu (zákal) v roztoku se děje pouze v
úzkém rozmezí koncentrací, které se nazývá zóna ekvivalence.
ekvivalence
K precipitaci dochází vazbou bivalentních Ab na antigen, který
je multivalentní - vytvoří se nerozpustná síťová struktura.
struktura
Fab fragmenty precipitát neposkytují. Podobně se precipitát
netvoří u monoklonálních protilátek, které váží antigen s více
kopiemi jediného epitopu.
Precipitace vyžaduje malý nadbytek Ag (2:1). Kvantifikace
měřením rozptylu světla (nefelometrie
nefelometrie) nebo jeho pohlcování
(turbidimetrie
turbidimetrie) zákalem. Imunoprecipitace se kombinuje s SDSPAGE pro semikvantitativní detekci proteinů.
9
Př. Studium membránových Ag imunoprecipitací.
imunoprecipitací
Proteiny v b. membráně se radioaktivně značí metabolickou
cestou - např. použitím jodovaných aminokyselin. Buňky jsou
pak lyzovány detergentem. Membránové částice s antigeny jsou
vychytány přídavkem monoklonálních protilátek vázaných na
nerozpustné částice nosiče - vytvoří se nerozpustné komplexy.
Vše ostatní se vymyje. Komplexy AbAb-Ag se štěpí přídavkem
SDS,
uvolněné
proteiny
se
separují
SDS-PAGE
a identifikují dle
SDS
radioaktivity.
Interakce v gelu
1. Radiální imunodifuse.
imunodifuse V 1-2% agarovém gelu obsahujícím
protilátku jsou vyřezány kruhové jamky pro aplikaci různě
zředěného antigenu. Ag difunduje do gelu a dle jeho koncentrace
vznikají různě široké precipitační prstence (dosažení
ekvivalence). Kvantifikace s kalibrační přímkou.
10
2. Dvojitá imunodifuze.
imunodifuze Protilátka a antigen se umístí do
různých jamek na opačné konce agarového gelu a ponechají se
difundovat proti sobě. Precipitační linie se vytvoří v místě
příslušné ekvivalence v poloze mezi Ab a Ag. Obsahuje-li
vzorek Ag více složek (rodílné mobility) rozpoznávaných
stejnou Ab, vznikne více precip. linií. Semikvantifikace,
studium antigenních determinant.
3. Ouchterlonyho imunodifuze.
imunodifuze Čtvercový agarový gel,
centrální jamka,
jamka periferní jamky umístěny v kruhu kolem
jamky centrální. Do centrální jamky se dávkuje protilátka, do
periferních jamek různé antigeny. Po difuzi a vytvoření
precipitačních linií můžeme posoudit, identitu, částečnou
identitu nebo naprostou odlišnost těchto antigenů.
11
Imunoelektroforetické metody jsou podstatně rychlejší a a
pro analýzu tudíž efektivnější než metody imunodifuzní.
4.. Raketová imunoelektroforéza.
imunoelektroforéza Provádí se v agarovém gelu
s protilátkou. Na katodové straně se dávkuje antigen o různé
koncentraci. Ab-Ag komplexy tvoří obrazce podobnému
plamenuům hořícího paliva rakety. Hodnota pH (~ 8.0)
zajišťuje, že Ab a Ag migrují do opačných směrů.
5. Křížová imunoelektroforéza. Protilátka a antigen se
dávkují na opačných stranách agarosového gelu, Ag na
katodové straně, Ab na anodové. Po připojení zdroje el. napětí
se Ab a Ag pohybují proti sobě (nutné správné pH) a v místě
dosažení koncentrační ekvivalence se vytvoří precipitační linie.
12
6. Imunoelektroforéza pro směsi antigenů.
antigenů
Provádí se ve dvou krocích. Nejprve se směs antigenů
vpravená do dvou centrálně umístěných jamek separuje
zónovou elektroforézou.
Do podélné („slot-like“) jamky v gelu, která je mezi jamkami
pro antigen) se vnese protilátka. Jamka je paralelní s osou
provedené elektroforézy pro separaci antigenů.
Ab difunduje proti separovaným antigenům,
antigenům tvoří se
obloukovité precipitační linie. Poloha linií odpovídá mobilitě
antigenů separovaných elektroforézou.
Kvalitativní i kvantitativní analýza směsi antigenů.
13
Radioimunoanalýza (RIA)
Jedna z nejcitlivějších a nejpřesnějších metod analýzy (až
pg/mL). Založena na kompetici radioaktivně značeného a
neznačeného antigenu o vazbu na protilátku. Může být
prováděna dvěma způsoby:
1. Smísí se Ag* (známá konc.) a Ag (neznámá konc.) a směs se
inkubuje se specifickou protilátkou (volně v roztoku).
Následuje přídavek sekundární protilátky,
protilátky komplex AbAg/Ag* je takto precipitován, separován, v precipitátu se měří
radioaktivita. Primární protilátka může být immobilizována,
např. na stěně zkumavky, pak se zkumavka po přídavku směsi a
inkubaci pouze vymyje.
2. Protilátka reaguje nejdříve pouze se značeným antigenem a
přídavky neznačeného antigenu o různé koncentraci různě
vytěsňují Ag* z vazby. Ab-Ag* se tak doplňuje Ab-Ag.
14
Značení - 125I a 131I pro proteinové antigeny, tritium nebo 14C
pro nízkomol. látky. Radioaktivita se měří např. scintilací. Pro
kvantifikaci nutná standardizace.
15
ELISA
Dnes nejběžnější imunoanalýza v biochemických a klinických
laboratořích. Stejná specifita a srovnatelná citlivost jako u RIA.
Detekce spočívá v přeměně chromogenního substrátu
nějakým enzymem (alkalická fosfatasa, křenová peroxidasa),
který je ve formě konjugátu s antigenem nebo protilátkou.
Komplex protilátky s antigenem je immobilizován na pevný
povrch - plastové mikrotitrační destičky.
Existuje několik způsobů provedení: přímá ELISA,
ELISA nepřímá
ELISA,
ELISA kompetitivní ELISA,
ELISA sendvičová ELISA.
ELISA
Liší způsobem provedení detekce, immobilizované jsou buď
protilátky nebo antigeny.
Přímá ELISA
Pro detekci antigenu (virus, bakterie;
rekombinantní peptid či protein, ale i
jiné antigeny). Protilátka pro detekci
je značena (HRP, AP, FITC). Po
vymytí nadbytku Ab-konjugátu se
přidá chromogenní substrát pro tvorbu
zbarvení nebo se měří fluorescence.
Ab-konjugát je komerční
připravený v laboratoři.
nebo
16
Nepřímá ELISA
Opět
immobilizovaný
antigen.
Nejdříve se Ag inkubuje s primární
protilátkou a její nadbytek se
vymyje. Sekundární protilátka konjugát se váže na primární Ab,
nadbytek se opět vymyje. Positivní
reakce - ve vzorku musí být přítomna
primární Ab.
Podmínkou spolehlivosti je, že
sekundární Ab neváže immobilizovaný Ag ani nepřilne na stěny
mikrotitrační destičky.
Sendvičová ELISA („capture“, „sandwich“ ELISA)
Varianta se záchytem antigenu.
antigenu
Protilátka vážící Ag je immobilizována (může to být i test jejího
titru). Přídavek Ag, vymytí. Přidá
se značená protilátka, která váže
zachycený Ag. Přísné podmínky
podobně jako u nepřímé ELISA značená Ab nesmí reagovat s
immobilizovanou Ab. Značená Ab
by měla být z jiného obratlovce
(králík - koza). Nesmí být
nespecifická vazba s pevnou fází.
17
Sendvičová ELISA
Varianta se záchytem protilátky.
protilátky
Immobilizovaná protilátka váže
protilátky ze vzorku (např. lidské
IgG, IgA nebo IgM ze zkoumaného
séra pacientů). Po vymytí se přidá
specifický antigen a nakonec antiAg konjugát poskytující signál.
Značená Ab nesmí reagovat s Ab
ve vzorku bez přítomnosti Ag.
Nesmí ani vytvářet nespecifickou
vazbu s pevnou fází
Při sendvičové ELISE může být použito i sekundární protilátky.
18
Kompetitivní nebo blokovací ELISA
U kompetitivní ELISA se zkoumané
sérum inkubuje společně se značeným
anti-Ag konjugátem. Antigen je vázán na
nosič. Kompetice o vazbu, čím více Ab v
séru, tím silnější zbarvení. Nutná
standardizace.
U blokovací ELISA se nejdříve přidá
zkoumané sérum. Nadbytek se po
inkubaci vymyje. Pak se přidá anti-Ag
konjugát, který vytěsňuje zkoumanou Ab
z vazby.
Komp. ELISA má varianty s immobilizovanou protilátkou.
protilátkou
Nespecifické vazby protilátek mohou být odstraněny blokováním
stěn ELISA destiček 0.1% roztokem BSA.
19
Používané substráty pro peroxidasu v Ab-konjugátech:
3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin
2,2´-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát) - ABTS
o-fenylendiamin
o-dianisidin
o-toluidin
Používané substráty pro alkalickou fosfatasu v Ab-konjugátech:
4-nitrofenylfosfát
Western blotting a dot blotting
Jde o metody s vysokou citlivostí pro detekci proteinů
separovaných elektroforézou, obě jsou založené na použití
specifických protilátek. Proteiny (= antigeny) jsou vázány
na membránu,
membránu nejčastěji se používá hydrofobní PVDF.
U dot blottingu se protein aplikuje přímo na membránu bez
počáteční elektroforetické separace. Detekce je stejná jako u
Western blottingu (viz dále). Pro kvalitativní a
semikvantitativní stanovení.
Při Western blottingu se proteiny nejdříve separují
elektroforézou (SDS-PAGE). Následuje blotting na PVDF
membránu. Stejně jako u dot blottingu, vazebná místa na
membráně musí být blokovány inertním proteinem (BSA,
želatina, odtučněné mléko) před aplikací protilátek.
20
Pro viditelnou detekci se používá Ab-konjugát s enzymy
(HRP, ALP) nebo protein A konjugát s HRP.
Pro Western blotting je třeba jiných enzymových substrátů
než pro ELISA;
ELISA je nutné, aby poskytovaly precipitující
barevné produkty.
Př. pro peroxidasu se používají diaminobenzidin a 4-chlor-1naftol; pro ALP se používá 5-brom-4-chlorindoxyl
fosfát/nitrotetrazoliová modř.
Detekční limit proteinů je tak 1 ng/mm2 membrány.
O 22-3 řády citlivější je použití luminiscenčních detekčních
technik (fluoresc. substráty pro Ab-konjugáty s enzymy).
Emitované světlo lze zachytit např. film.
21
Mikroskopické techniky imunofluorescence a imunogold
Protilátky lze využít k in vivo detekci látek v buňce nebo
buněčných organelách. Jako sekundární protilátky se používají
fluorescenční konjugáty (fluorescein, rhodamin, FITC) nebo
konjugáty s částečkami zlata (připravují se redukcí kyseliny
tetrachlorzlatité, průměr několik nm). Vazba částeček je
elektrostatická, závislá na pH (obvykle ~ 7).
Detekce se provádí viditelným (pro imunogold) či fluorescenčním
(pro imunofluorescenci) mikroskopem na tkáňových řezech.
Elektronová mikrosk. dává přednost imunogold konjugátům.
Při imunofluorescenční mikroskopii lze detekovat simultánně dvě
látky, pokud se použijí konjugáty s různými fluorescenčními
značkami. V EM se analogicky použijí různě velké částečky zlata.
Přímý test
22
Nepřímý test
23
FACS - fluorescence activated cell sorting
Průtoková cytometrie („flow cytometry“) je technika pro
rychlé měření jednotlivých částic/buněk, které procházejí
snímačem. Argonový laser umožňuje analýzu mnoha
parametrů na základě odklonu laserového paprsku. Úroveň
tohoto odklonu odpovídá velikosti a granularitě (denzitě).
Cytoplazmatické znaky (antigenní determinanty) v buněčné
membráně mohou být značeny fluorescenčním konjugátem
monoklonálních protilátek.
protilátek Je tak možné určit přítomnost,
denzitu i distribuci těchto znaků. Analogicky lze studovat i
vnitřní znaky, např. obsah DNA. Cytoplazmatické znaky jako
tzv. diferenciační znaky (Clusters of Differentiation - CD)
umožňují určovat specifické buněčné subpopulace - například
CD4+ T lymfocyty značené monoklonální protilátkou proti
znaku CD4 na jejich povrchu.
až 107 b. /h
tolik obsaženo
např. v 1 mL
krve
24
Flow cytometry is a technique for counting, examining and sorting microscopic particles suspended in a stream of fluid. It
allows simultaneous multiparametric analysis of the physical and/or chemical characteristics of single cells flowing through
an optical/electronic detection apparatus.
A beam of light (usually laser light) of a single frequency (colour) is directed onto a hydrodynamically focused stream of
fluid. A number of detectors are aimed at the point where the stream passes through the light beam; one in line with the light
beam (Forward Scatter or FSC) and several perpendicular to it (Side Scatter (SSC) and one or more fluorescent detectors).
Each suspended particle passing through the beam scatters the light in some way, and fluorescent chemicals in the particle
may be excited into emitting light at a lower frequency than the light source. This combination of scattered and fluorescent
light is picked up by the detectors, and by analysing fluctuations in brightness at each detector (one for each fluorescent
emission peak) it is possible to deduce various facts about the physical and chemical structure of each individual particle. FSC
correlates with the cell volume and SSC depends on the inner complexity of the particle (i.e. shape of the nucleus, the amount
and type of cytoplasmic granules or the membrane roughness). There are now some flow cytometers on the market that have
eliminated the need for fluorescence and use only light scatter for measurement. Measurable parameters are:
volume and morphological complexity of cells
cell pigments such as chlorophyll or phycoerythrin
DNA (cell cycle analysis, cell kinetics, proliferation etc.)
RNA
chromosome analysis and sorting (library construction, chromosome paint)
proteins
cell surface antigens (CD markers)
intracellular antigens (various cytokines, secondary mediators etc.)
nuclear antigens
enzymatic activity
pH, intracellular ionized calcium, magnesium, membrane potential
membrane fluidity
apoptosis (quantification, measurement of DNA degradation, mitochondrial membrane potential, permeability changes,
caspase activity)
cell viability
monitoring electropermeabilization of cells
oxidative burst
characterising multi-drug resistance (MDR) in cancer cells
glutathione
various combinations (DNA/surface antigens etc.)
This list is very long and constantly expanding.
25