Identifikace drog - imunochemické testy

Identifikace drog v pevném stavu pomocí spektrálních metod
imunochemické diagnostické testy
Identifikace drog v pevném stavu pomocí spektrálních metod –
infračervená spektrometrie
Spektrální metody představují ve forenzní chemii jedny z hlavních a dynamicky se
rozvíjejících metod. Umožňují objektivní identifikaci neznámé látky na základě různých
fyzikálně-chemických principů.
Jednou z metod, které se ve forenzních laboratořích běžně používají je infračervená
spektrometrie (IR). Infračerveným zářením rozumíme elektromagnetické záření v rozsahu
přibližně 800 nm až 1000 µm. Na rozdíl od spektrometrie ve viditelné nebo UV oblasti, kdy je
principem absorpce záření excitace valenčního elektronu na vyšší energetickou hladinu,
využívá infračervená spektrometrie záření s nižší energií. Při absorpci infračerveného záření
molekulou dochází ke změnám v jejich vibračních stavech, které jsou charakteristické pro
určité vlnočty (namísto vlnové délky se v IR používá jednotka vlnočet – jde o reciprokou
hodnotu vlnové délky vyjádřené v cm-1).
Atomy v molekulách vibrují na určitých frekvencích. Je-li frekvence IR záření shodná
s frekvencí vibrace daného atomu, dojde k absorpci tohoto záření. Mnohé funkční skupiny
jsou charakteristické svými vlnočty a tak lze kromě identifikace neznámé látky rovněž získat
alespoň základní informace o její možné struktuře. Klasickou metodou infračervené
spektroskopie je transmisní měření IR spekter, při kterém dochází k absorpci IR záření
zkoumanou látkou. Výsledkem je tzv. infračervené spektrum, které poskytuje jak zmíněné
informace o některých funkčních skupinách, tak v oblasti cca 200 – 1500 cm-1 také tzv. „otisk
prstu“, který je pro každou individuální chemickou struktury charakteristický, a lze jej použít
k identifikaci neznámé látky.
Výhodou IR je možnost měření vzorků jak v kapalném stavu (např. tenký film), tak ve stavu
pevném (homogenizací a slisování tablety s KBr nebo tzv. nujolová metoda, při které je látka
měřena v chemicky inertním minerálním oleji). Značnou nevýhodou infračervené
spektroskopie je fakt, že voda (jakožto nejběžnější rozpouštědlo) vykazuje silnou absorpci IR
záření a je nutné analyzované vzorky, stejně jako veškerý použitý materiál důkladně vysušit.
Infračervená spektrometrie se v analýze drog využívá především k rychlé identifikaci
chemického složení pevné drogy, při záchytu drog (drogový dealeři, letiště, kontrola
nelegálních skladů apod.). Vychází se z předpokladu, že hlavní substancí v zadržené látce je
samotná droga.
Postup práce je velice jednoduchý. Zadržená látka, která pravděpodobně obsahuje drogu se
smíchá s pevným KBr (obvykle v poměru 1:100 ve prospěch KBr). Z této směsi se vylisuje
tableta, která se proměří v IR spektrometru. Následuje identifikace srovnáním získaného
spektra neznámé látky s knihovou spekter, případně se proměří i standard.
Tento jednoduchý postup se využívá v kriminalistických laboratořích ke konečné identifikaci
hlavní substance v zadržených podezřelých látkách. Bohužel tento postu není vhodný pro
rychlý předběžný průkaz přímo v terénu. Pro tyto účely jsou pak vhodné barevné reakce, které
je možné udělat ihned po zadržení podezřelé látky.
Barevné reakce drog („pill testing“)
Vzhledem k tomu, že organických látek vč. kontrolovaných substancí (návykové látky, léčiva,
prekurzory apod.) existují tisíce, před vlastní instrumentální analýzou je vhodné předběžnými
kvalitativními metodami zúžit okruh možných látek nebo některé zcela vyloučit. Kromě
základního fyzikálně-chemického popisu (vzhled, barva, krystalická struktura, rozpustnost,
fluorescence, zápach, pH roztoku apod.) je lze některými předběžnými reakcemi prokázat
nebo vyloučit přítomnost neznámé látky ve vzorku.
Chemické reakce vedoucí k úplné či předběžné identifikaci podezřelé látky (návykové látky,
psychofarmaka či jiného léčiva) představují širokou škálu metod založených na jednoduchých
testech, které v ideálním případě vyloučí či přímo potvrdí přítomnost zkoumané látky ve
vzorku. V mnoha případech se jedná o běžné chemické reakce využívané zejména
v kvalitativní analýze organických sloučenin založených na více či méně selektivních
reakcích různých funkčních skupin s určitým činidlem. Existuje celá řada postupů a metod,
kterými lze prokázat hledanou látku ve vzorku. Obecně platí, že pro praktické aplikace je
vhodné nalézt co nejvíce specifický test, který probíhá za běžných podmínek (laboratorní
teplota, dostupná rozpouštědla, materiál apod.), využívají se při něm netoxické chemikálie a
lze jej nejlépe provádět i mimo laboratoř (tzn. např. na místě činu, při policejních či celních
kontrolách apod.) a jejichž použití a vyhodnocení zvládne i osoba bez odborného vzdělání
v příslušeném oboru. Mnohé z těchto testovacích reakcí pak využívají i samotní konzumenti
nebo distributoři návykových látek aby předešli možné nebo záměrné záměně za látku jinou,
mnohdy podstatně nebezpečnější (tzv. „pill testing“).
Předběžný test je obvykle prováděn s několika činidly a to se vzorkem přímo v pevném stavu
(např. krystalický metamfetamin) nebo po jeho převedení do roztoku v příslušném
rozpouštědle (nejčastěji voda nebo polární organická rozpouštědla jako např. methanol nebo
ethanol). Níže je uveden přehled nejběžněji používaných chemických činidel, která se v praxi
využívají k detekci široké škály podezřelých látek.
1.) Marquisova reakce
Jedná se o jednu z nejběžnějších předběžných reakcí při testování podezřelých látek.
Využívá se jí nejen při analýze drog ale rovněž k identifikaci alkaloidů či běžně
používaných léčiv, což výrazně snižuje její selektivitu. Nicméně její relativní
jednoduchost a zejména kombinace s doplňujícími testy (viz níže) může vést k dostatečně
věrohodnému průkazu hledané látky ve vzorku. Využívá se především při testování
extáze (MDMA), drog odvozených od amfetaminů (deriváty fenylethylaminů) a opiátů.
Marquisovou reakcí lze od sebe např. rozlišit nejčastěji zneužívané drogy – MDMA a
metamfetamin, které mnohými dalšími reakčními činidly odlišit nelze.
Jako činidlo se využívá směs koncentrované kyseliny sírové a formaldehydu (100 mL
98 % kyseliny sírové se opatrně smíchá s 5 mL 38-40 % vodného roztoku formaldehydu).
Mechanismus reakce je poměrně složitý, obecně lze říci, že je založen na polymerizaci
molekul zkoumané látky a formaldehydu v prostředí kys. sírové, kdy vznikají nabité
oxoniové nebo karboniové sloučeniny (obr. 1). Příklad reakce Marquisova činidla
s látkami amfetaminového typu je uveden na obr. 2.
R
O
R
+
O
C
R
C
R
+
R
R
Obr. 1: Oxoniový resp. karboniový ion.
R
N
H
CH3
R
R
N
N
H
H
CH3
+
C
CH3
CH3
Obr. 2 : Marquisova reakce amfetaminu (R = H) nebo metamfetaminu (R = CH3).
Marquisovo činidlo je vhodné zejména pro opiáty, se kterými poskytuje tmavě fialové
nebo červenofialové produkty. Naopak častá náhražka nebo „ředidlo“ drog na bázi opiátů
(heroin, morfin, kodein atp.), dextrometorfan (DXM) poskytuje s tímto činidlem temně
černou sraženinu. Lze tak snadno odlišit DXM od jiných opiátů nebo opioidů. S látkami
amfetaminového typu vznikají produkty červené až hnědé barvy, které postupem času
tmavnou.
Obsahuje-li molekula methylendioxidový skelet (např. MDMA) pak je zbarvení fialové.
Marquisovo činidlo však reaguje i s mnoha běžnými látkami (z nichž se některé mohou
vyskytovat jako ředidla pro fiktivní zvětšení dávky drogy). Mezi tyto látky patří např.
cukry (sacharóza, glukóza), které mají charakteristickou tmavě hnědou barvu. Typická je
pak reakce s kyselinou acetylsalicylovou (aspirin), které poskytuje červený nebo
oranžový produkt (avšak až po delší době cca 2-3 min) a může tak vést k falešně
pozitivnímu závěru na přítomnost amfetaminů.
2.) Simonovo činidlo
Simonovo činidlo je relativně selektivním činidlem pro aromatické sekundární aminy
(jeho modifikace známá jako Robadopovo činidlo pak také pro aminy primární).
Pozitivní reakce se projeví jako světle či tmavě modré zbarvení, při nižší koncentraci
zkoumané látky často až po několika minutách. Jedná se o reakci sekundárního aminu
s acetaldehydem za vzniku enaminu, který následně reaguje s nitroprussidem sodným za
vzniku immoniové soli, která je následně hydrolyzována na tzv. Simon-Aweův komplex
(Obr. 3). Ten je charakteristický svým modrým zbarvením.
Obr. 3: Simonova reakce s metamfetaminem za vzniku barevného Simon-Aweova komplexu
s nitroprussidem sodným.
Reakce je poměrně selektivní, avšak reaguje s mnoha jinými sekundárními aminy a proto
je nutné potvrdit přítomnost hledané látky i dalším testem.
3.) Chen-Kaovo činidlo
Některé látky, které jsou samy považovány za drogy nebo jejich prekurzory nereagují
s žádným běžným činidlem. Typickým příkladem je efedrin a jeho deriváty (vč.
enantiomerů). Ačkoli je efedrin rovněž sekundární amin, obsahuje ve své molekule
hydroxylovou skupinu a díky tomu poskytuje negativní reakci se Simonovým činidlem.
Vzhledem k tomu, že efedrin a jeho deriváty (pseudoefedrin, chloroefedrin,
chloropseudoefedrin apod.) jsou důležitými výchozími látkami při syntéze
metamfetaminu (obr. 4), je činidlo na tento typ látek velice důležité.
A)
B)
Obr. 4: Syntéza metamfetaminu z efedrinu (resp. chloroefedrinu, A) a stereoselektivní syntéza z (+) nebo
(-) pseudoefedrinu redukcí kyselinou jodovodíkovou za katalýzy fosforem (nejčastější ilegální metoda).
Chen-Kaova reakce využívá vznik fialového nebo modrého komplexu s ionty mědi
(obr. 5) a je více méně selektivní pro fenylalkylaminy s vicinálními amino a hydroxy
skupinami. S látkami amfetaminového typu reakce neprobíhá. Reakce však může
probíhat také s norefedrinem nebo chloroderiváty efedrinu. Zbarvení pak bývá tmavě
modré. Vzniklý komplex je možné extrahovat do nepolárního rozpouštědla, např. diethyl
etheru nebo n-butanolu.
Obr. 5: Chen-Kaova reakce s efedrinem (resp. norefedrinem) za vzniku komplexu s měďnatými ionty.
4.) Detekce THC pomocí diazoniových solí řady „Fast“
Tzv. Fast soli jsou diazoniové sloučeniny využívané v analytické chemii a biochemii
především jako barviva nebo derivatizační činidla. Několik látek z této řady však
umožňují značně selektivní detekci THC v marihuaně a produktech z ní. Jednou
z nejpoužívanějších je Fast Blue B (nebo také BB, obr. 6).
Obr. 6: Struktura soli Fast Blue B
Tato látka reaguje v bazickém prostředí se dvěma molekulami THC za vzniku
charakteristicky zbarvené sloučeniny (obr. 7). Barva a rychlost reakce záleží na typu
barviva, v praxi se nejčastěji používá zmíněná Fast Blue B (pozitivní reakce se projeví
jasně červenou barvou) a dále pak Fast Garnet GC (výsledná barva je oranžová), Fast
Blue RR (výsledná barva je růžová) nebo Fast Corinth V (výsledná barva je fialová).
Nejběžnější metodou detekce je provedení extrakce podezřelé látky (např. sušené
marihuany nebo hašiše) do etanolu s následným přídavkem zvolené Fast soli (obvykle
smíchané s bezvodým síranem sodným v poměru 1:100). Bazické prostředí je zajištěno
přidáním několika kapek 2-5 % roztoku uhličitanu sodného. Pokud barva extraktu
znemožňuje pozorovat barevnou změnu, lze barevný produkt vyextrahovat do
nepolárního rozpouštědla (např. chloroform).
Obr. 7 – Výsledný produkt reakce THC s diazoniovým barvivem Fast Blue B.
Imunochemické testy pro detekci drog
Zatímco barevné reakce spolu s infračervenou spektrometrií umožňují identifikovat přímo
drogu ve zdrojovém materiálu (zadržený prášek, tablety apod.), není možné tyto metody
využít pro přímou orientační identifikaci zneužití drog a dalších omamných a psychotropních
látek. Je také potřebné vzít do úvahy, že po požití a absorpci drogy dochází v drtivé většině
případů k její metabolizaci a koncentrace původní formy v biologickém materiál postupně
klesá. V tomto případě lze využit imunochemické diagnostické testy.
Imunochemické metody jsou založeny na specifické reakci antigenu (resp. analytu)
s přítomnou protilátkou. Podmínkou je existence specifické protilátky, která je citlivá na
přítomnost analytu ve vzorku. Tyto metody pracují na principu kompetice mezi analytem
a značeným analytem (nejčastěji radioaktivně, fluorescenčně, enzymaticky atd.) o přítomnou
protilátku. Detekce analytu je poté založena na jeho schopnosti vytěsnit značený analyt
z vazby na protilátku. Jedná se o technicky nenáročné metody, které jsou však často
nedostatečně specifické, a proto je nutné potvrdit pozitivní výsledek jinou objektivní
analytickou metodou. V současné době pracují specializované laboratoře s automatickými
imunoanalyzátory, které jsou schopny rychle analyzovat především biologické vzorky. Pro
rychlou orientační analýzu nebo potvrzení však existují i jednorázové imunochromatografické
testy, které pracují na obdobném principu s vizuálním vyhodnocením výsledku (obr. 8).
Obr. 8: Imunochromatografický test s naznačeným vyhodnocením výsledku.
Imunochromatografické testy fungují na principu chromatografického vzlínání vzorku
podobně jako třeba papírová chromatografie nebo TLC. Testovaný vzorek vzlíná do oblasti,
kde je umístěna značená protilátka (v těchto případech obvykle barevně). Pokud testovaný
vzorek neobsahuje hledanou látku (nebo je její obsah nižší než je detekční limit daného testu),
nedojde k navázání protilátky (tedy ani ke kompetici) a v určité oblasti testu se protilátka
naváže na tzv. drogový protein (který je imobilizovaný v testu). Negativní výsledek se potom
projeví jako dvě viditelné barevné zóny (viz obrázek 8). V opačném případě přítomný analyt
zamezuje navázání protilátky na drogový protein a sám s ním vytvoří komplex. To se projeví
jako chybějící barevná zóna v testu. Pro ověření funkčnosti testu musí být druhá (tzv.
kontrolní) zóna vždy pozitivní bez ohledu na přítomnost hledané látky.
Imunochemické testy mohou být vysoce specifické (např. test na THC, resp. jeho metabolit),
na druhou stranu však mohou reagovat neselektivně s celou řadou podobných látek včetně
metabolitů. Tento fakt je nutno brát v potaz při vyhodnocení výsledku a imunochemický test
by měl vždy sloužit spíše jako rychlá a orientační metoda k potvrzení nebo vyloučení
hledaných látek.
Úkol:
1) Proveďte identifikace neznámého prášku s pomocí barevných reakcí na drogy a
dále s pomocí infračervené spektrometrie.
2) Proveďte identifikaci zneužité drogy v moči s pomocí imunochemických
diagnostických testů.
Pomůcky a chemikálie: bromid draselný, roztoky činidel (Marquisovo, Chen-Kaovo,
Simonovo, Fast Blue B), imunochemické diagnostké testy, infračervený spektrometr, lis na
tablety.
Doplňující otázky:
1. Které další spektrální metody je možné využít k rychlé identifikaci drog v pevném či
kapalném stavu?
2. Je možné pro identifikaci drog využít kromě imunochemických metod také
enzymatické metody?
Použitá literatura:
1. A. C. Moffat: Clark Analysis of Drugs and Poisons, 3rd edition, Vol. 1, Pharmaceutical
Press, 2004.
2. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, 4th edition, AACC Press, 2013.
3. http://www.dancesafe.org/testing-kit-instructions/.